基因编辑或改造的技术有哪些

① 基因编辑技术原理

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

ZFN，TALEN，CRISPR/Cas 都是重要的基因编辑工具，均可以通过靶向目的基因，从而高效特异地改造基因组的序列，在生命科学、医学和农业植物育种等多个方面都有成功的应用。但3种编辑技术各的优势同时也存在一定局限。

② 目前流行的基因编辑技术有哪些

目前流行的基因编辑技术有：锌指核酸酶ZFN，TALEN，CRISPR-Cas技术。
CRISPR-Cas技术包括Cas9，Cas12，Cas13，dCas9-Fok1，CasX，Cas3，还有primeeditor，还有各种各样的单孝唤碱基编辑技术（有的也是基于Cas9改造而来）。
当然这些工具有的已经广泛使用，有的还在巧链凯实验室阶段。所有这些技术不唤老过才经历了五六年，发现速度太快了，以后会有更多。

③ 基因编辑技术及其应用科普漫谈

DNA是绝大部分生物的遗传信息的储存介质，由腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）四种核苷酸组成，并且严格遵守A-T,C-G的碱基互补配对原则，DNA链上这四种核苷酸的排列信息就是生物体的主要遗传信息。基因是控制生物性状的基本遗传单位，即一段携带特定遗传信息的DNA序列，主要通过翻译出对应的效用蛋白发挥功能。

图3 基因编辑技术的基本原理示意图

要实现基因编辑，外源切割复合体必须满足两个条件：

①切割复合体必须可以特异性地识别和结合至目的基因DNA序列上，这是各种基因编辑技术的主要差异所在，也是发展基因编辑技术的最大困难所在；

②切割复合体必须具有切割DNA，制造断裂端的功能；

基因编辑技术的简要发展历史

自1953年沃森和克里克两位科学家提出DNA的双螺旋结构以来，人们一直都在积极探索着高效便利的基因编辑技术：

上世纪80年代，科学家在小鼠胚胎干细胞中通过基因打靶技术实现了基因编辑（2007年诺贝尔生理医学奖），但此技术在其余细胞内效率极低，应用受到了极大的限制；

上世纪90年代，基于细胞内不同锌指蛋白可特异性识别DNA上3联碱基的特征以及核酸酶FokI二聚化后可以切割DNA的特点，人们通过锌指蛋白偶联Fokl的策略逐渐发展出了一种新的基因编辑技术--锌指蛋白核酸酶技术（Zinc Finger Nucleases, ZFNs）。但此技术专利被公司垄断，且锌指蛋白数量有限，可以识别的DNA序列数量有限，其应用也受到了很大的限制。

随后，基于改造后的植物病原菌中黄单胞菌属的TAL蛋白可以特异性识别DNA中一个碱基的特性，人们又发展出了新的基因组编辑技术--转录激活样因子核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）。此技术理论上可以实现对任意基因序列的编辑，但其操作过程较为繁琐，一定程度上限制了其应用。

近年来，基于细菌规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)系统发展而来的新一代基因组编辑技术--CRISPR/Cas9技术，使得基因编辑变得更为简易、高效。值得提出的是，华裔科学家张锋教授对于CRISPR/Cas9技术的发展与应用作出了重要贡献，是目前这一领域的领军人物之一。

基因编辑技术的最新发展

由于目前最为广泛应用的CRISPR/Cas9技术仍然存在着无法对所有基因序列实现编辑、可能错误编辑其余基因、切割复合体中RNA容易降解导致复合体不稳定等一些不足之处，人们主要从以下几个方面优化发展新的基因编辑技术：

1)优化CRISPR的蛋白序列，使得其可以识别更多的序列，并且能够更为有效地编辑基因序列；

2) 寻找新的具有特异性识别和切割目的基因序列的蛋白。如张锋教授在去年报道的Cpf1，已被证实为一类新的基因编辑工具；而目前引起广泛争议和关注的我国河北科技大学韩春雨教授在今年初报道的NgAgo，如果其真的可以实现细胞内的基因编辑，也是一类新的基因编辑工具，是目前各种基因编辑工具的有效补充；近期，我国南京大学学者又开发了一类新的基因编辑工具—SGN，也引起了学界的广泛关注。

基因编辑技术的应用

随着CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术的迅猛发展，基因编辑技术在诸多方面都有着极为广阔而光明的应用前景：

1) 畜牧业和农业方面，现在已经在包括鸡、牛、羊等重要家畜和玉米、水稻、棉花等重要经济作物中实现了基因改造，有效地提高了这些家畜和经济作物的产量和质量；

2) 医疗健康方面，一方面，对于先天性基因突变致病患者，利用基因编辑技术改正突变的基因，可以为这些疾病的彻底根治提供希望。如在2013年，我国科学家上海生化细胞所的李劲松教授就利用CRISPR/Cas9技术治愈了小鼠的白内障遗传疾病。另一方面，基因编辑技术还有望为彻底治愈一些重大疾病的提供希望，如利用基因编辑技术改造艾滋病病毒HIV-1携带者免疫细胞中的CCR5基因，可以使得细胞不再受HIV-1病毒感染，有望成为彻底战胜艾滋病的有力武器。

结语：

迅猛发展的基因编辑技术正在给我们的生活带来巨大的变化，在享受先进科学技术带来的种种福利的同时，我们也必须进一步加强对于基因编辑技术的基础研究以及应用管理，以确保这一先进技术得到正确而有效地应用。

编辑：何郑燕 鲁凡英

（专家：吴剑锋，厦门大学生命科学学院博士，科普中国微平台原创首发）

④ 基因编辑技术是什么它是如何在医学领域应用的

基因编辑技术可以准确地改造人类基因，达到基因治疗效果。中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组通过在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9纠正白内障小鼠模型中的遗传缺陷，所产生的后代是可育的并能将修正后的等位基因传递给它们的后代。杜氏肌营养不良（DMD）是一种罕见的肌肉萎缩症，也是最常见的致命性遗传病之一，是由肌营养不良蛋白dystrophin基因突变引起。杜克大学Charles Gersbach研究组应用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中将dystrophin基因突变的23外显子剪切，而合成了一个截短的但功能很强的抗肌萎缩蛋白，这是生物学家“首次成功地利用CRISPR基因编辑技术治愈了一只成年活体哺乳动物的遗传疾病”。

►CAR-T治疗简图，图片来自onclive.com

基因编辑技术联合免疫疗法在肿瘤及HIV/AIDS治疗具有广泛的应用前景。嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）细胞治疗是非常有前景的肿瘤治疗方法。CAR-T细胞疗法在B细胞恶性血液肿瘤治疗中已经取得硕果。中科院动物研究所王皓毅研究组利用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞中进行双基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美国斯隆凯特林癌症纪念中心Michel Sadelain研究组发现CRISPR/Cas9技术将CAR基因特异性靶向插入到细胞的TRAC基因座位点，极大增强了T细胞效力，编辑的细胞大大优于传统在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中产生CAR-T细胞。

继诺华的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接连上市，CRISPR Therapeutics公司也在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术开发同种异体CAR-T候选产品。2016年10月，四川大学华西医院的肿瘤医生卢铀领导的一个团队首次在人体中开展CRISPR试验，从晚期非小细胞肺癌患者体内提取出免疫细胞，再利用CRISPR/Cas9技术剔除细胞中的PD-1基因更有助于激活T细胞去攻击肿瘤细胞，最后将基因编辑过的细胞重新注入患者体内。

微生物种群与人体医学，自然环境息息相关。北卡罗来纳大学Rodolphe Barrangou与Chase L. Beisel合作通过使用基因组靶向CRISPR/Cas9系统可靶向并区分高度密切相关的微生物，并程序性去除细菌菌株，意味着CRISPR/Cas9系统可开发成精细微生物治疗体系来剔除有害致病菌，人类将有可能精确控制微生物群体的组成。以色列特拉维夫大学Udi Qimron将CRISPR系统导入温和噬菌体中在侵染具有抗生素抗性的细菌以消灭此类细菌，CRISPR系统已具有成为新一类抗生素的潜力。Locus BioSciences公司也在开发在噬菌体中开发CRISPR系统以达消灭难辨梭菌的目的。

弗吉尼亚理工大学Zhijian Tu研究组在雄蚊子中进行M因子基因编辑，可以导致雌雄蚊之间的转化或雌蚊的杀戮，从而实现有效的性别分离和有效减少蚊子的数量，也将减少寨卡病毒及疟疾等传播。

基于CRISPR治疗不仅可以应用于根除共生菌或有益菌群的病原体，也可应用于靶向人类病毒，包括HIV-1，疱疹病毒，乳头瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有纯合的32-bp缺失（Δ32）的CC趋化因子受体5型（CCR5）基因的患者对HIV感染具有抗性。因此加利福尼亚大学Yuet Wai Kan在诱导多能干细胞iPSC中利用CRISPR系统引入纯合CCR5Δ32突变后，诱导分化后的单核细胞和巨噬细胞对HIV感染具有抗性。天普大学Kamel Khalili 课题组应用CRISPR/Cas9系统在宿主细胞基因组中精确编辑HIV-1 LTR U3区，从而在将艾滋病病毒从基因组中剔除。

Cas12a （Cpf1）属于CRISPR家族另一核酸内切酶，它也可被gRNA引导并剪切DNA。但是，它不仅可以切割相结合的单链或双链DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大学伯克利分校Jennifer Doudna研究组开发了基于CRISPR的一项新技能——基因侦探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用单链DNA将荧光分子和淬灭分子连接构建成一个报告系统，当CRISPR-Cas12a在gRNA引导下结合到目标DNA并发挥剪切作用时，报告系统中的DNA也被剪切，荧光分子将被解除抑制。此系统在致癌性HPV的人的DNA样品检测HPV16和HPV18变现极佳。

布罗德研究所Feng Zhang研究组开发的基于CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活后，可以切割除靶序列外其他的RNA的特征，引入了解除荧光分子的抑制。此工具可实现一次性多重核酸检测，可同时检测4种靶标分子，额外添加的Csm6使得这种工具比它的前身具有更高的灵敏度，并将它开发成微型试纸条检测方法，简单明了易操作，已被研究人员成功应用于RNA病毒，如登革热病毒和寨卡病毒，及人体液样本检测。

Broad研究所David R. Liu研究组利用CRISPR/Cas9开发了一种被称为CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的记录细胞事件的“黑匣子”他们利用这个系统开发出两种细胞记录系统，在第一种被称为“CAMERA 1”的细胞记录系统中，研究人员利用细菌中质粒的自我复制但又严格控制其自身数量的特征，

将两种彼此之间略有不同的质粒以稳定的比例转化到细菌中，随后在接触到外来药物刺激时，利用CRISPR/Cas9对这两种质粒中的一种进行切割，通过对质粒进行测序并记录两种质粒比例的变化来记录细菌接触外来刺激的时间。另一种细胞记录系统被称为“CAMERA 2”，它利用基于CRISPR/Cas9的碱基编辑系统实现在细胞内特定信号发生时改变遗传序列中的单个碱基，以此实现对诸如感染病毒、接触营养物等刺激的记录。这套技术的出现将很大程度的帮助人们进一步了解细胞的各类生命活动的发生发展规律。

2015 年 4 月，中山大学的黄军利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，同源重组修复了胚胎中一个引发地中海贫血β-globin gene （HBB）的突变。

►图片来自kurzgesagt.org

2016年，广州医科大学的范勇团队在三原核受精卵中，应用基因编辑技术CRISPR受精卵中的基因CCR5进行编辑引入CCR5Δ32纯合突变由于当时脱靶效率问题突出，产生了镶嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒冈健康与科学大学胚胎细胞和基因治疗中心Shoukhrat Mitalipov研究组公布了其应用CRISPR在人类胚胎中进行DNA编辑的结果，纠正了突变的MYBPC3基因，其突变会引起心肌肥厚并将年轻运动员猝死。