免疫印迹技术有哪些

Ⅰ 免疫学的检测方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。
1． 体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。
2． 细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。
体液免疫检测法
1.凝集反应。
颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。
1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。⑴玻片法：多用于抗原的定性检测。⑵试管法：多用于抗体的定量检测。
2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。
根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。
2．沉淀反应。
可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。
1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。
2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。单克隆抗体技术
3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。
3．中和试验。
特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。
4.免疫荧光法（荧光抗体法）。
是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。包括直接法和间接法。
5．酶联免疫吸附试验。
本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。
6．溶血空斑试验。
7．免疫印迹技术。
免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)
抗体抗原反应
创建的DNA印迹术(Southernblotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。
细胞免疫检测法
近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。二十一世纪初期，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。
1．淋巴细胞转化试验。
人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。2000年开始出现一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色成分。该产物的多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪(595nm）测量光密度，作为MTT法的指标。
2．E-花环法。
人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经37℃培养5～10分钟后放4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞，此法可用来分离T细胞。
3．T细胞亚群检测。
4．细胞毒试验。
Tc细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞等对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。
抗体制备
常用的检测方法是51Cr（铬）释放法，将51Cr-Na2CrO4盐水溶液与靶细胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如NK细胞的靶细胞为K562），于37℃培养1小时左右，51Cr即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待测细胞毒的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1），靶细胞杀伤越多，释放到上清液中的游离51Cr就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。
5．巨噬细胞吞噬功能的测定。
将中药(10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2大小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡，内含巨噬细胞。取水泡液0.5ml加鸡红细胞悬液0.01ml，37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检，计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观察。
6．移动抑制试验。
致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因子(MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无MIF产生，以测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。
7．时间分辨荧光测量技术。
时间分辨荧光测量技术(time-resolvedfluorometry,TrF）是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。
8．细胞因子检测技术。
细胞因子的检测，2005年起在中医临床及实验室中已广泛应用。
9．细胞受体的检测。
受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。

Ⅱ 免疫学技术知识总结 第三章

第三章 经典免疫学技术

第一节 沉淀反应

一、沉淀反应的原理

沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在溶液或者凝胶中特异性结合后，如果两者比例合适，可相互作用形成不溶性的免疫复合物，出现肉眼可见的不溶性沉淀物。（比例合适时，由分子热运动引起。）

二、沉淀反应的类型

（一）溶液中的沉淀反应

是指在清澈透明的特异当中，呈现溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹薄片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的须状或颗粒状的不溶性物质。

溶液中沉淀反应有：

1.     絮状沉淀反应

絮状沉淀法就是指将抗原与抗体相结合之后在适当的电解质存在条件下，抗原抗体形成肉眼可见的絮状沉淀物。

特点：方法受抗原抗体比例的影响显着；应用于测定抗原抗体反应的合适比例上。

絮状沉淀法的三种方法：

抗原稀释法：抗原最适比例

抗体稀释法：抗体最适比例

方阵滴定法：抗原抗体最适比例

2.     环状沉淀反应

环状沉淀法是又叫毛细管内沉淀反应，是常见的一种检测抗原抗体浓度的方法。在毛细管内，上面是抗原，下面是抗体，中间有一道平衡区即为沉淀，但假如不同种抗原或者抗体之后，就会发现不同浓度的抗原抗体所形成的环状沉淀位置不同。抗原浓度越高，抗体浓度越低，出现的的沉淀越接近管底部。

1.     免疫比浊法

免疫比浊法的基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。

优点在于：矫正曲线稳定、简便快速、已与自动化、没有放射性核素污染。缺点在于灵敏度差，特异性较差。

免疫比浊法的分类：透射比浊法、散射比浊法、免疫胶乳浊度测定法、速率抑制免疫比浊法

2.     免疫沉淀技术（经典免疫学沉淀技术）

加入特异性抗体、沉淀试剂形成混合抗原，离心沉淀之后沉淀抗原，经过电泳分离之后放射自显彰。

3.     免疫共沉淀技术

免疫共沉淀技术的原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose

beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

优点在于：1.可以检测细胞内相互作用蛋白质的天然活性，2.检测证实细胞环境中的蛋白质相互作用，3.获得天然状态下的相互作用的蛋白质复合物。

免疫共沉淀的局限性在于：1.难以检测低亲和力和短暂的相互作用。2.不能确切的分辨第三种蛋白的桥联作用。3.灵敏度不如亲和色谱高。4.需要对未知蛋白有一定新的了解。

免疫沉淀的应用范围：应用于蛋白质相对含量的测定，蛋白质修饰水平等分析，蛋白质相互作用的研究。

（二）凝胶中的沉淀反应

1.     单向免疫扩散实验：在琼脂糖中加入抗体，形成抗体凝胶，抗原加入后，抗原根据浓度大小自由扩散，与抗体形成沉淀环，抗原浓度越大，沉淀环越大。

2.     双向免疫扩散试验：抗原抗体都会发生扩散，但两者相互扩散形成沉淀线之后就表示出了浓度，形成的沉淀线离抗原越近，说明抗原的浓度越大。

3.     免疫电泳：免疫电泳法是将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而使其相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。多用来分析抗原比较复杂的抗原复合物。

4.     火箭电泳试验：凝胶含有抗体，叫抗原跑胶之后形成峰值，峰值越高，说明抗原浓度越高。

5.     免疫印迹技术：WB将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

第二节 凝集反应

一、凝集反应原理

凝集反应：颗粒型抗原与相应抗体结合，在适当电解质纯爱下，形成肉眼可见的凝集团块。凝集原和凝集素

凝集反应的特点：

1.

凝集反应中抗原颗粒较大，长期浸渍或者沉淀可以自然沉降。

2.凝集反应中凝集块主要由抗原组成，沉淀反应中沉淀块主要有抗体组成。

3.在您肌肤那英中，需要稀释免疫血清中的抗体，是抗体不至于过多；而在沉淀反应中，为了防止抗原过多们一般都会稀释抗原（即沉淀反应中的抗体过量，凝集反应中一般都是抗原过量）

二、凝集反应的类型

1.直接凝集反应：是将细菌或红细胞与其相应抗体结合产生的细菌凝集或者红细胞凝集。

（1）微生物凝集反应：肥达式反应，用已知的伤寒杆菌O、H抗原与甲乙型副伤寒杆菌H抗原，与病人的血清做定量凝集试验，一测定患者血清中无相应抗体的存在，作为伤寒、副伤寒的诊断参考。

（2）同种红细胞凝集反应：血型检验

2.间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）包被在不溶性颗粒表面，与响应抗体（或抗原）在适宜条件下结合形成凝集团块。

反应类型：

（1）正向间接凝集反应：将抗原先吸附在载体表面，然后与相应的抗体结合产生的凝集反应。

（2）反向间接凝集反应：将特异性抗体先结合在载体表面，然后与相应的抗原发生凝集反应。

（3）间接凝集抑制反应：先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的载体颗粒，若出现凝集现象，则说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合。

3.桥梁凝集反应：也就相当于二抗的应用

4.共同凝集反应：抗原抗体都是颗粒型，又称为协同凝集反应，指由两种颗粒成分相互作用而发生的凝集反应。

（1）细菌共同凝集反应：金黄色葡萄球菌与IgG抗体结合之后形成抗体致敏的SPA，与抗原结合之后通过协同凝集形成细菌共凝集。

（2）玫瑰花结试验：常见的有E花结、EA花结和EAC花结。E花结是由内绵阳血红细胞和T细胞以及50%的NK细胞；E花结是由抗体致敏的红细胞与B、T、NK、粒细胞、单核巨噬细胞共同组成；EAC花结是由补体致敏细胞和B细胞组成。

第三节 补体参与的抗原抗体反应

一、补体参与的抗原抗体反应的原理：利用补体来测定反应体系中抗原抗体的存在情况，并通过红细胞裂解与否进行示踪。

二、补体参与的抗原抗体类型

1.补体参与直接的抗原抗体反应：

（1）溶血反应：能从反应系统中50%的致敏绵羊红细胞发生溶血的血清的量，即为每毫升血清中补体的含量。

（2）溶菌反应每毫升血清中补体的含量=1/血清用量×稀释倍数

2.补体参与简洁的抗原抗体反应：溶菌反应常作为某血清中是否含有相应抗体的检测方法。

（1）补体结合试验；华氏反应，基本原理为含有抗体的血清再加入抗原、补体、溶血素之后不会发生裂解。但是不含有抗体的血清再加入一系列物质之后会发生裂解。只加入抗原或者抗体都会不发生裂解。

（2）被动红细胞溶血试验：吸附抗原的红细胞在有相应抗体和补体的情况下出现了红细胞溶解的现象。

（3）溶血空斑试验：是一种测定B细胞产生和蜂蜜抗体功能呢个的体外实验。

直接溶血空斑试验：脾脏淋巴细胞在绵阳血红细胞琼脂上培养，加入补体之后，会与抗原抗体结合，红细胞溶解形成空斑。

间接溶血空斑试验：一般用于测定溶血效率较低的IgG或者IgA抗体，夫纳音过程中需要加入抗球蛋白抗体辅助溶血空斑的形成。

改良型溶血空斑试验：将直接溶血空斑试验分别用致敏红细胞和淋巴细胞代替，加入补体之后形成空斑。

反向溶血空斑试验：二抗对一抗的广增反应。

第四节 中和反应

一、中和反应的原理：即将被检血清与病原微生物混合，经过适当时间作用后，接种到宿主系统（包括动物、级配或者培养细胞），按照对其产生的保护效果的差异，可以判断该微生物或毒素是否被综合，并计算出综合的程度。

有中和抗体和抗毒素

二、中和反应的类型

1.终点法中和反应：根据地定被血清中和后的参与独立，来判断血清中中和抗体的效价。中和指数=实验组LD50/对照组LD50

（1）固定病毒稀释血清发：线固定病毒的毒价，再与等量的递进稀释的待测血清混合。

（2）固定血清稀释病毒法：先将病毒原液做10被递进稀释，分别与等量的正常血清、待测血清混合，计算中和指数。

2.蚀斑减少中和反应

抗体效价为：蚀斑数较少50%的血清稀释度