什么是黄龙病pcr技术

❶ 目前检测柑橘黄龙病的常用方法是什么

中南农业科技开发研究所果树黄龙病科研室介绍，检测柑橘黄龙病的常用方法如下：
柑桔黄龙病的检测是一个从传统生物学向分子生物学、从定性检测到定量检测的发展过程。从观察病状，生物鉴定，电镜与超薄切片技术，血清反应，到PCR反应等技术，对黄龙病诊断和检测的研究，经历了很长时间，取得很大的进步。目前，使用PCR技术诊断黄龙病，已达到快速、准确的定性与定量的要求。

1、田间诊断
研究柑桔黄龙病的困难，在于它的病原无法人工培养｡因此,长期以来对黄龙病的诊断,主要依据典型的黄梢和叶斑驳症状｡柑桔感染黄龙病后，全年均可表现症状，在田间以夏梢、秋梢发病最多，其次是春梢。新抽出的病梢, 其叶片不能正常转绿, 表现均匀黄化或呈斑驳症状。这样症状是十分明显和较为特异的, 具有诊断的脊握价值。目前，主要选择各个新梢的成熟期，特别是在每年的10～12 月秋梢成熟以后，症状表现的最适期间，根据当年春梢叶片的斑驳症状来诊断田间的黄龙病病树，可以达到相当可靠的程度。但是，症状的发展过程会受到环境条件的影响。例如在果园管理不良、营养缺乏或其他病虫危害严重的情况下，病树若不表现典型症状则难以诊断。这也是造成对黄龙病有种种混淆看法的一个主要原因。因此，症状诊断必要时要与鉴别寄主(芦柑) 的生物学测定相结合。

2、电镜观察
自1 977～1978年间利用电镜与超薄切片技术，在柑桔黄龙病病树叶片的筛管细胞内发现病原类细菌以来（柯1979、陈作义1979 1980），电镜便成为诊断黄龙病的一个重要手段。在电镜下，病原BLO的形态、大小及菌体的壁膜结构等特征都能观察得清楚，可以做出正确的诊断。但是，由于柑桔病树体内BLO浓度较低，分布不均匀以及电镜制样采用的叶脉较小等因素的影响，电镜对BLO的检出率偏低，多在60～70％之间。近来，采用症状明显、老熟的叶片为材料，采用侧脉代替中脉和纵切代替横切韧皮部制样，能够有效地提高电镜对BLO的检出率。

3、血清学检测
柑桔黄龙病病原属于难培菌，仅限于感病柑桔韧皮部筛管细胞，含量低、分布不均匀，导致抗血清制备艰难。利用兔丝子成功地将黄龙病菌从柑桔转到草本植物长春花上，黄龙病菌能够得到比在柑桔树体内更好的生长与繁殖，菌体浓度较高，为直接从长春花病株中提纯黄龙病病原奠定了基础（1986-通过、1987-回接）。从发病长春花粗提纯黄龙病病原（柯穗帆野手 1988），以粗提纯黄龙病病原为抗原制备了小鼠抗腹水，由于所提取病原的浓度和纯度较低，该鼠抗腹水效价低，并伴有非特异反应，难以推广应用（1989-提纯）。随后的研究表明，以类似方法制备的小鼠抗腹水尽管其效价有了较大提高，能够比较准确的检测发病长春花中的黄龙病病原，但是对未显症或初显症柑桔植株，以及部分具典型病状的柑桔叶片的检测并无血清学反应（1992 李德望）。有利用国外机构提供的多克隆抗体成功检测柑桔黄龙病病原的报道（1993 张）。

国内对柑桔黄龙病单克隆抗体的研制并未获得满意的结果。福建省农业科学院果树研究所柑桔黄龙病组，曾以柑桔黄龙病菌粗提纯物为抗原，筛选到二个杂交瘤细胞株(CF1 和CF2)能分泌抗黄龙病病原的单克隆抗体。采用免疫荧光法检测，抗体能识别长春花和柑桔病株，前者产生强荧光反应，后者产生弱荧光反应，而长春花和柑桔健株以及长春花感染MIO（植原体）的病株均不产生荧光反应（田1998）。柑态嫌桔黄龙病的单克隆抗体多仅适用于免疫荧光检测，尚难用于酶联免疫吸附测定法（ELISA），所以单抗的应用受到很大的限制。

4、组织化学诊断
主要基于两个原理，一是感染黄龙病菌的寄主植物，其韧皮部坏死细胞群或经化学染色后的愈伤组织，在荧光的激发下会形成特殊的荧光而加以诊断。如以透射式荧光显微镜观察，健叶和病叶叶柄切片在荧光的激发下，木质部导管胞壁发黄色荧光, 韧皮纤维发绿色荧光, 但感染黄龙病的病组织切片, 在韧皮部中则可看到1～多个鲜明的黄色或黄绿色荧光团块（坏死细胞群），但取样必须是完全老熟的黄化叶片, 而且以病秋梢的结果最稳定，嫩梢、嫩叶以及感染黄龙病但尚未表现症状的叶片，因未产生坏死细无法检测（1987-直接荧）；苯胺兰作为荧光色素染色后，荧光显微镜下，病叶切片韧皮部愈伤组织会发出明亮的、不正常的黄绿色荧光，其强弱与症状有关，斑驳叶荧光最强，其次为黄化后期缺素状叶，健叶没有或只有稀疏的几点黄绿色荧光。其准确性同样受取样时间和取样部位的影响，以夏梢和秋梢叶片转绿而尚未充分老熟时取中脉切片染色观察，准确性最高（1988-组织）。
二是韧皮部坏死细胞群或病原菌经化学染色后，能够使坏死细胞群或病原菌与柑桔韧皮部筛管细胞分色，达到在光学显微镜下进行区分的诊断的目的。如番红染色感染黄龙病的柑桔叶柄切片，显微镜下可观察到韧皮部出现特有的红色团块，这种特征性红色团块可以作为鉴定黄龙病的依据（1987-显微镜）；以FBA法浸染新梢主脉或嫩茎切片，能使病原体与柑桔韧皮部筛管细胞分色，光学显微镜下可观察到病原的形态（1990 应用FBA）。显微镜观察法方便直观，但易受取样部位、取样时期和制样方法(切片厚度等)的限制，容易造成漏检，实际生产中少有采用。

5、生化指标诊断
用聚丙烯酞胺凝胶电泳法（PAGE）分析柑桔蛋白质种类上的差异，感染黄龙病的病株中，存在一种健株所没有的特异性蛋白质，这种差异蛋白质与供试柑桔种类和症状严重度无关，也不存在于类似黄龙病症状的生理性病株中。因此，可凭借特异性蛋白的有无加以诊断。（1987-快速）。贡柑的黄龙病病株果实同工酶，缺少Rf=0.24的主酶带，可能是贡柑感染黄龙病早期检测的生化指标。(吉前华郭雁君梁广坚姚金明，2007)。

6、 PCR检测
（基因克隆与分析2002-琯溪/2000 DNA片段。1996-多聚、1998-诊断法。/PCR：1996-应用PCR、1998-Application、1999-Diagnosis、1999-快速、2003-沙田、2004-16S rDNA、PCR-SSCP、2005-广佛手、2006-优化、2006-采样、2007-不同引物、2007-野生、2007-孟祥春、2007-微芽、）
7、我们农民朋友最直接了当的检测方法就是看到根不烂了、叶不黄了、果实可以成熟有经济价值了，就叫治好黄龙病。

❷ 什么是PCR技术

PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2ⁿ倍。

PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件：（①变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火；使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。

3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3’方向复制出互补DNA。

(2)什么是黄龙病pcr技术扩展阅读

【技术原理】

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

【工作原理】

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”。

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

【工作步骤】

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

❸ 什么是PCR技术PCR的基本原理是什么

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

(3)什么是黄龙病pcr技术扩展阅读

PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

❹ 什么是pcr技术典型的pcr技术分为几个步骤

Pcr技术是指DNA的体外扩增技术，也叫DNA多聚酶链式反应，该技术分为变性、复性和子链延伸三个步骤，变性是高温下DNA解开双链，复性是DNA模板链与引物配时，子链延伸是按碱基互补配对原则合成子链。

❺ 什么是PCR主要的技术步骤是什么

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一灶蠢消方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段隐知两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。
主要的技术步骤是：
（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。
（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物档罩沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

❻ PCR技术是什么

PCR技术的基本原理：

该技术是差衡铅在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

PCR技术的应用：

PCR技术拦烂首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血虚好的基因突变开始的。

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。

PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。

❼ pcr是什么意思 怎么理解pcr是什么意思

1、PCR是聚合酶链式（PolymeraseChainReaction）反应的简称，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响卜轮纯不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。

2、PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互桐纤补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复型咐制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

❽ 什么是PCR技术

PCR技术也就是基因扩咐嫌增技术，它是通过基因扩增仪，在细胞外进行DNA复制，由1个DNA分子增加到2个，然后依次增加到4个，8个…，使分子数目呈几何级数增加，以在短时间内获得足够的DNA，供研究用的一种技术。

PCR技术的出现，使生物学的研究一大突破。在PCR技术问世之前，人们无法查出爱滋病病毒感染者，因为这种病毒在感染者体内的含量很少，衡橘手且难于培养。在PCR技术问世之后，可将爱滋病病毒的核酸进行扩增从而查出受感染者，并可研究治疗方法。

PCR技术已经在分子生物学中发挥了重要作用。可以预知，它在遗传病诊断、治疗，在动、植物育种，以及在司法破案等方面，将会发挥更大的作用伍清。