免疫标记技术如何标记hrp

A. 酶标签去除，HRP（辣根过氧化物酶）标记抗体的原理及操作流程是什么 具体怎么弄

HRP标记抗体的方备乎法 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2. 标记步骤 (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出猜滚亏液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐穗神水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。…………………… ……………………………… 更多具体材料请参考： 酶标签去除 http://proct.bio1000.com/100165/

B. HRP标记抗体或抗原，最常用的方法是（）。

【答案】：B
改良过碘酸钠法是目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用的方法。

C. 免疫酶标记抗原的抗体常用底物是什么

酶标记抗哗巧体与相应的抗原发生反应，这里说它相应的抗原也可以是另外抗原的抗体。因为本身抗体也可作为另一种抗体的抗原。比如说western
blot里面的一抗，二抗
酶标记抗体是由相关的酶与抗体结合，此抗体是与相应的抗原结合，即与抗原发生抗原抗体反应。这里的酶是一种特别的酶。凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应乱渣键满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(ap)，其次梁嫌还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
本人用得比较多的是辣根过氧化物酶(hrp)的酶标记抗体。

D. ELISA HRP标记技术原理及步骤是什么

原理：利用抗原能吸附到固相载体表面的特性，使抗原抗体行团启反应在固相载体表面进行的免疫酶技术，从而简化了抗原抗体结合物档如分离的手续。
基本步骤：1包被：既是把抗原或抗体吸附到固相或核反应板上；2抗原抗体反应；3酶促反应。

E. 免疫印记检测法

检查原理：将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场凳搭力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种缓粗仔蛋白的表达量差异。

优点
免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点：
1、 湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作；
2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔；
3、 免疫印迹分析只需少量试剂；
4、 孵育、洗涤的时间明显减短；
5、可同时制扰汪作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定；
6、结果以图谱形式可长期保存；
7、 免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。

F. 有关HRP标记问题

能显色，说明你的HRP标记BSA成功了。用BSA封了的孔也显色（理论上不显判携色），最大的可能是你的稀释度不卖败够，ELISA灵敏度很高的，你如果标得好的话，应该是要稀释一万到十万倍，这样阴性值才会不高。
你用BSA封闭没什么意思，可以换一种，比如明胶，酪蛋白等。
将HRP标记BSA稀释成一定的梯中冲颤度。

G. 骨组织免疫组化实验步骤（HRP-DAB法）

1. 拷片
石蜡切片37℃烤箱过夜（前一天放入烤箱，也可不做该步）。
脱蜡前于60℃烤箱烘烤2h。

2. 脱蜡与水化
依次将切片放入二甲苯I、II各10min。
乙醇梯度（100%、95%、80%、70%）各5min。
水洗5min。
TBS 3min×3，之后滤纸擦干组织周围，颂段指甲油描边。

3. 抗原修复（二选一）
3.1 透明改唤质酸酶+胃蛋白酶修复（推荐）
透明质酸酶 37℃ 30min，TBS 3min×3；
胃蛋白酶 37℃ 30min，TBS 3min×3。

3.2 胰酶修复
0.125%胰酶 37℃ 20min，室温冷却10min，TBS 3min×3。

4. 封闭
5%BSA封闭液 37℃ 30min， 甩干不洗。
5. 孵育一抗
TBS或PBS稀释一抗。4℃湿盒过夜。

6. 孵育二抗
TBS 5min×5。
3%H ₂ O ₂ 滴加于切片上，室温避光10min。
滴加聚合HRP标记二抗，37℃，30min。
TBS 5min×5。
7. DAB显野歼誉色
依照DAB显色试剂盒说明书配制DAB显色液，

显微镜下观察控制显色时间，蒸馏水终止。

8. 复染
苏木素复染（镜下观察控制）。
饱和磷酸一氢钠溶液返蓝。
9. 封片
脱水：70%、80%、95%、100%乙醇各3min。
透明：二甲苯I、II各5min。
中性树胶封片（从一侧封片，且封片时勿将二甲苯去除，片子放其中一个个封片）。

注意事项：

H. 免疫组化原理、流程及结果分析

免疫组化原理
免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。
通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和****HE****染色的对比
DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法:
组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。
1、 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。
复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物袭森素-过氧化物酶复合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）
本身没有连接生物素，但有两汪磨个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。
3、 PAP法
4、 直接法

样本制备

免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则：
1 、必须设阳性对照和阴性对照。
2 、 抗原表达必须在特定部位。
3 、 阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表

从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因:
1、拍陵亩 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。
2、 所有切片均呈阳性反应。
3、 所有切片背景过深。
4、 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:
1、 切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。
2、 缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。
3、 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。
4、 抗体温育的时间过长。
5、 H ₂ O ₂ 浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:
1、 内源性过氧化酶没有完全阻断。
2、 切片或涂片过厚。
3、 漂洗不够。
4、 底物呈色反应过久。
5、 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因:标本固定和处理不当。

注意事项：
1、 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。
2、 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。
3、 以下原因可能导致片子着色不均匀：
①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。
②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。
③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。
⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。
⑥制片厚薄不均匀等问题。
⑦染片盒不平，切片倾斜。
4、 一抗的清洗:
1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。
3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。
5、 PBS的PH和离子强度的使用：
1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。
2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。
6、 拍照：
1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

I. 请教关于HRP标记二抗的免疫组化方法

亲，你这问题咋解决了？

J. 酶联免疫法的酶标记法

酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙氏羡二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然团核信后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时塌轮，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。