如何提高crispr技术

Ⅰ CRISPR、CRISPR screen以及与单细胞测序的结合

首先来介绍一些CRISPR，它首先在大肠杆菌中发现，全称为：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic  Repeats【成簇的有规律的间隔短回文重复】

1、 repeat ：short DNA ，20-40bp，Palindromic回文【DNA转录后，回文结构会形成发卡结构】

2、 spacer DNA ：间隔序列，将repeat间隔开【 spacer DNA可以和病毒DNA 完美匹配 ，特别是噬菌体DNA】

3、 cas ：CRISPR-associated【与CRISPR相关的基因】

【 cas蛋白具有解旋酶活性，可以将DNA链解旋，同时具有核酸酶桥知活性，可以切割DNA链 】==>>因此，这敏蠢消是细菌的一个免疫系统，通过这种方法，细菌可以抵抗其敌人：噬菌体

因此： 只要知道目标DNA 的序列，把它做成guide RNA，融合到cas蛋白上，就可以特异性的把这段序列切掉。

接下来，学习一下CRISPR技术的一个应用——CRISPR基因筛选

利用功能缺失的策略进行的高通量遗传档燃筛选 ，是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。CRISPR基因筛选，可以通过 CRISPR gRNAs 靶向不同细胞中成百上千各异的基因，然后通过实验筛选编辑细胞，gRNA 可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。然而，这种筛选方法比较适用于回答与细胞生长能力直接相关的问题。

如果我们想研究基因调控和其它复杂的生物控制机制，就要明白多个基因是如何协同工作还有调控调节细胞状态。这就需要针对每个CRISPR靶向基因，分别进行培养，编辑和分析细胞。

这时候可以采用 CRISPR + inDrop scRNA-seq

在此，引用一篇通俗易懂的文章，很赞！！！

参考：

https://www.bilibili.com/video/BV15x411Z7kf?p=2

https://www.jianshu.com/p/cd402fc588af

Ⅱ CRISPR/Cas9指南

成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，即 CRISPR ）II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。在CRISPR/Cas9广泛应用之前，像锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子类效应核酸酶（TALENs）等基因工程技术，都需要使用定制的DNA结合蛋白核酸酶，这需要科学家为每个基因靶标设计和生产新的核酸酶对(nuclease-pair)。（相比而言，）CRISPR主要因其简单性和适应性，已迅速成为基因工程中最受欢迎的方法之一。

CRISPR包括两个部分：一个向导RNA( gRNA )和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associated endonumclease即 Cas9 )。向导RNA是一个短的合成RNA,由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位点）组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。因此我们只需改变gRNA上的靶向序列即可改变Cas9的基因靶标。CRISPR最初用于敲除各种细胞类型或生物体的靶向基因，但对Cas9酶的改造已经将CRISPR的应用扩展到选择性激活或抑制靶向基因或纯化特定的DNA区域，甚至可以和荧光显微结合用于展现活细胞中的DNA。而且，产生gRNAs的便捷促使CRISPR成为了最具扩展性的基因编辑技术之一，近来已被应用于基因组水平的筛查。

这篇指南将提供CRISPR/Cas9生物学方面的概览，介绍CRISPR的不同应用，帮助诸位在各自领域上开展CRISPR/Cas9的研究。

通过靶向基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9的共表达，CRSIPR/Cas9可用于产生敲除细胞或敲除动物。** 基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列握皮：**

PAM序列是结合靶标必不可少的，具体序列取决于Cas9的种类（酿脓链球菌Cas9 5’NGG3’）。我们将关注酿脓链球菌Cas9，因其目前广泛使用于基因工程。一旦表达，Cas9蛋轮雹白和gRNA将形成一个核糖体蛋白复合物，这个复合物是通过gRNA的scaffold区域和Cas9上表面暴露带正电荷的沟糟相互作用形成的。Cas9与gRNA的结合后构象发生了改变，分子由无活性的非DNA结合构象转变为有活性的DNA结合构象。更重要的是gRNA上的靶位点序列仍未和靶标DNA发生相互作用。Cas9-gRNA复合体将任意地结合基因组上的PAM序列，但是只有gRNA靶位点序列与靶标DNA配对时，Cas9才能进行切割（这段靶标DNA）。一旦Cas9-gRNA复合物结合到一段认定的DNA靶标，在gRNA靶向序列3’端的“种子”序列开始使靶标DNA退火。如果种子序列与靶标DNA序列配对，gRNA将持续的沿3’到5’端方向使靶标DNA退火。

只有当gRNA靶位点序列与靶基因有足够的同源性存在时，Cas9才会作用切割靶基因。拉链式的退火机制可能解释了为什么靶标上3’端种子序列上的错配会完全破坏对靶标的切割，而5’端的错配有可能会对靶标进行切割。Cas9核酸酶有两个功能性内切酶区：RuvC和HNH。当Cas9与靶基因腊皮帆位点结合时发生了第二次构象变化，核酸酶功能区对靶标DNA的反向链进行定位切割。Cas9介导的DNA切割最后结果是目标DNA（PAM序列上游约3～4nt）的双链断裂（double strand break，DSB）。

双链断裂后由以下两种常规的修复途径进行修复：

NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能快速的修复双链断裂，但通常会在双链断裂位点产生小的插入缺失。NHEJ介导的双链断裂修复的随机性具有重要的实用意义，因为Cas9和gRNA在细胞群体中的表达，将产生多种不同的突变。大多数情况下，NHEJ引起的靶标DNA上的小InDels，会导致阅读框内的氨基酸插入缺失，或者移码突变引起的目标基因上ORF提前终止。理想情况下，在靶标基因内形成功能缺失性的突变。然而，对特定的突变细胞表型的敲除能力最终取决于残存的基因功能的剂量。

当gRNAs设计准确时，CRISPR/Cas9具有很高的特异性，但是特异性依然是一个主要的关注点，特别是当CRISPR应用于临床时。CRISPR系统的特异性主要取决于gRNA靶向序列特异性如何，即基因靶标相比于基因组其余部分的情况。理想状态下，gRNA靶向序列与靶标DNA具有高度同源，而与基因组上其它位置没有同源性。（但）现实是，在基因组上，会有另外的位点与指定的gRNA靶向序列部分同源。这些位点被称为“脱靶”，你在设计gRNA时需要考虑到这些位点。

为了优化gRNA的设计，CRISPR的特异性可以通过改造Cas9自身来得到提升。如先前讨论那样，Cas9通过两个核酸酶功能区域，RuvC和HNH，的结合活性来形成双链断裂。每个核酸酶结构域上精确的氨基酸残基是已知的，这些残基序列对内切酶的活性至关重要（在酿脓链球菌Cas9中D10A对HNH和H840A对RuvC），Cas9酶的修正版已生成，它仅包含一个催化活性功能域(称为“Cas9 nickase”)。Cas9切口酶依然基于gRNA的特异性来结合DNA,但切口酶仅能切开DNA的一条链，形成一个切口“nick”,或使单链断开，而不是双链断裂。使用完好的互补链作为模板，DNA上的切口迅速地被HDR途径（同源性修复途径）修复。因此需要使用两个切口酶来切割靶标DNA的两条链以形成双链断裂（这种通常被称为“double nick”或者“al nickase”CRISPR系统）。这种需求迅猛地增加了靶特异性，因为这和在足够近的范围内双链断裂产生的两个脱靶的nicks的方式截然不同。因此，如果特异性或者减少脱靶的影响是考虑的关键因素，那么就采用双切口酶方法来产生两个nick引起的双链断裂。为了获得高特异性的基因编辑，切口酶系统也可以联合HDR（同源性修复途径）介导的基因编辑一起使用。

NHEJ介导的双链断裂修复不够完美，通常会导致基因ORF阅读框的中断，HDR能用于产生特异性的核苷酸改变（这也是人们所说的基因“编辑”），这种改变小到单核苷酸改变大到大片段插入（例如，添加一个荧光基团或者tag）。

为了利用HDR进行基因编辑，一段DNA”修复模板”序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同转入研究者感兴趣的细胞中。修复模板必须包含所需编辑位点以及紧邻靶标的上下游同源序列（称作左右同源臂）。每条同源臂的长度以及结合位点取决于想要进行的改变的大小。修复模板可以是一个单链寡核苷酸/双链寡核苷酸/双链DNA质粒，这因不同的应用而不同。值得一提的是，修复模板在基因组DNA不能带有PAM序列，否则修复模板将成为Cas9切割的合适目标。例如，PAM序列可以进行突变处理，以至于不再出现，但是基因编码区不受影响（也即，沉默突变）

即使在表达Cas9、gRNA和外源性修复模板的细胞中，HDR效率通常也比较低（低于修饰等位基因的10%）。因此，一些实验室人为地尝试加强HDR，有的是在HDR起作用时同步化细胞周期，有的是通过化学的或遗传学的抑制基因来参与NHEJ。HDR的低效性有许多重要的实用意义。首先，因为Cas9的切割效率相对较高，而HDR效率相对较低，一部分Cas9引导的双链断裂被NHEJ修复。也就是说，最后细胞群体中会包含一些野生型等位基因，NHEJ修复的等位基因，和/或一些所需的HDR编辑等位基因。因此，需要通过实验来验证所需的编辑是否存在，如必要的话，对所需编辑的克隆进行分离。

Ⅲ CRISPR-Cas9基因编辑技术简介

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风族历靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。

一、什么是CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒族穗扒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。

C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。

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1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）

CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。

①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。

②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。

③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫兆昌系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。

2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。

Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。

依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。

第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。

第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。

目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。

二、CRISPR-Cas9的作用原理

对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。

1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）

CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。

新间隔序列的获得可能分为三步：

第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。

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第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。

第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。

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2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）

CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。

3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。

随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。

三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…

tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR-Cas9的广泛应用

1、基因敲除（Knock-out）

Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除

2、基因敲入（Knock-in）

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率

3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）

Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

4、多重编辑（Multiplex Editing）

将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

5、功能基因组筛选

利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介 - 知乎 (hu.com)

Ⅳ 精准大海捞针--CRISPR screening专题

由于Addgene的篇幅太长，因此决定分为至少两个部分来介绍。
上期： 来自Addgene的CRISPR指南（1）
参考： CRISPR Guide

由于这个部分已经不是简单的看CRISPR guide了，中间还有查阅资料，文献阅读的工作，因此没有再冠以CRISPR Guide的名字。

某天晚上我和师妹在微信上描述CRISPR screening实验时，她表示惊叹说，师姐这难道不是精准的大大念悄海捞针吗？因此本期我们的文章标题使用了师妹非常精辟的描述。在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。

高通量是新时代生物技术的标配，从能一次完成超过5万个基因的PCR（RNA-seq）到细胞谱系追踪（barcoding），在不影响研究精准度的情况下，大大的降低科滚渣学研究时间和成本。依据我们前面的介绍，sgRNA将Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9结合到DNA上后剪切DNA，那么以下这几种情况则非常好理解：
（1）Cas9 + 1个sgRNA：针对一个基因进行编辑；
（2）Cas9 + 2个sgRNA：可针对两个基因进行编辑，或者可敲除两个sgRNA之间的大DNA片段；
（3）Cas9 + 多个sgRNA：可同时对多个基因进行编辑；
（4）Cas9 + 上万个sgRNA：同时对上万个基因进行编辑。

针对第3、4种情况，这多高辩个sgRNA的合集被称为CRISPR文库（CRISPR Library），文库的大小可从几十个sgRNA到十几万个sgRNA。文库的出现使得我们可以 同时对上万个基因进行编辑，再筛选出对某特定表型有明显作用的基因集，用于指导下一步研究 ，这一过程称为 CRISPR screening ，举例如下图：

从上图中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），并通过慢病毒转导的方式转入Cas9稳定表达或野生型细胞（D），pool sgRNA感染的细胞经过特定特征（耐药性等）区分后，通过NGS测序鉴定与特定特征相关的基因集。除了常规流程的展现，我们还需要注意到 构建pool library的工作量是相当大的 ，如张峰教授组的GeCKO v2 Library可针对19,050个编码基因，而为了提高编辑效率，每个基因都设计了至少6个sgRNA，因此整个library包含有123,411个sgRNA，每个sgRNA都要构建出相应质粒，整个library的构建花费不菲，而我们只需要用500美元即可从Addgene上购得，能够使用这样的工具，真得感谢这些巨人们。

CRISPR Library的类型也根据实验目的、物种、文库大小和投递方式分类，具体信息可以在Addgene网页上可以查看：

在设计CRISPR screening实验之前需要思考以下问题：
（1）CRISPR screening在准备阶段需要使用电转的方式扩增文库，并需要NGS测序来确定文库丰度，尽管目前已经有一些library可以选用化学感受态细胞进行扩增，但选用library之前一定要查阅清楚；
（2）CRISPR screening实验需要大量的细胞，因此对于一些无法扩增、数量有限且非常珍贵的细胞时，如原代细胞等，CRISPR screening则可能不适用；
（3）大多数CRISPR文库需要使用慢病毒将gRNA/Cas9传递到目标细胞。

因此，使用者需要充分考虑课题组的条件是否能达到以上要求。一旦确定实验条件适合，那么下一步就是选择library， 在选择文库时，也需要考虑以下几点 ：
（1）基因修饰的类型：敲除、激活还是抑制目标基因；
（2）gRNAs的数量：CRISPR Library可以针对整个基因组或某一类特定的基因，例如最近报道的用于增强CRT T细胞在实体瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36个目的基因。
（3）物种：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs对于特定生物体的基因组是唯一的，并且文库只与来自该生物体的细胞兼容。
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9，则直接使用即可；如骨架中无，需要搭配使用Cas9质粒或者要求细胞本身就表达Cas9。

大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投递系统， 一般有这几种骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下图） 等，区别在于前者的骨架中已带有Cas9，因此是一个质粒系统；而后者需要叠加使用一个Cas9质粒。

每个CRISPR文库都是不同的，然而大多数CRISPR文库有几个共同的特性：首先，每个基因文库通常包含3-6个gRNAs，以确保每个靶基因的编辑效果，因此CRISPR文库包含数千个针对多种基因的独特gRNAs；CRISPR文库的gRNA设计通常是优化选择high on-target和low off-target的gRNA；敲除文库通常针对5' 组成性表达的外显子，而激活和抑制文库则针对启动子或增强子区域。

虽然含有Cas9的慢病毒文库是目前最流行的CRISPR筛选方法，但它们并不适用于所有的细胞类型或实验。AAV骨架的哺乳动物CRISPR文库主要用于体内实验，逆转录病毒形式的文库可用于慢病毒转导效率差的细胞中。此外，由于技术问题，CRISPR在细菌中的应用较少，但仍有几个细菌CRISPR文库通过dCas9作用达到抑制效果。

在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，作者为探讨调控HIV病毒潜伏的关键基因，作者首先构建HIV的荧光报告细胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），当HIV病毒复制的时候，GFP也同时表达，因此可以通过绿色荧光来观测HIV病毒的活动情况。

在HIV-GFP报告细胞中，转入sgRNA library进行大规模基因敲除，一定时间后用FACS分选出强绿色荧光表达细胞，经过4个循环后则得到了低荧光（HIV潜伏）和高荧光（HIV活动）两组细胞，通过NGS测序发现两组细胞中的sgRNA丰度情况，经过3次重复后得到257个基因对HIV病毒活动有正向作用，最后通过数据分析筛选出TOP的gene集。后续可针对TOP基因集进行针对性的验证。

通过这个例子，我们还可以想象，把GFP细胞换成肿瘤药耐药细胞如厄洛替尼，将FACS分选换成给药+不给药两组，一定时间后检测两组细胞的sgRNA丰度差别，则可以找到厄洛替尼耐药相关的基因。

（1）需要注意骨架中的启动子是否适合自己的目的细胞，例如CMV启动子非常广谱，但对于人胚胎干细胞的效率则非常低，需要选用带有EF1α启动子的骨架。
（2）部分library要求细胞本身就表达Cas9，这本无可厚非，但部分细胞在高表达Cas9的情况下非常脆弱，这时候需要考虑使用incible Cas9 system，而这个系统的构建本身就是有难度的实验，因此在设计可提前一定要做好全面分析。
（3）Library扩增工作量非常大，需要尽可能的严格按照protocol进行，并且配备质粒超大提试剂盒，部分Library要求使用特殊的感受态细胞，而该细胞之外国外出售并且非常贵。
（4）由于Library非常庞大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的转染试剂则花费非常大，此时可以考虑使用PEI40000等便宜且效果又好的转染试剂。
（5）此外，慢病毒的包被需要选择状态好且代数低的293T细胞，如果有293FT细胞则效果更佳。
（6）考虑筛选标记的冲突，例如目的细胞是通过慢病毒转染的方法稳定表达Cas9，且筛选标记是puromycin，那么几乎所有的Library的抗性筛选基因都是puromycin，这就冲突了。

具体更多的细节还需要我们去发现。

Ⅳ NEPA21-让Crispr-Cas9基因编辑技术与类器官培养研究如虎添翼的利器

类器官

类器官（Organoids），是指利用成体干细胞（ESCs）或诱导式多能干细胞（iPSCs）进行体外三维（3D）培育的具有一定空间结构的组织类似物。类器官能高度模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。类器官模型是介于细胞系和动物模型之间的一种新型功能化体外模型，可用于解析遗传发育、建立疾病模型、筛选药物和检测毒性以及探索个性化医疗方案。迄今为止世界各国科学家陆续培养出脑、肝、胃、肺、肠、肾脏和胰腺等各种类器官。

2013年，类器官技术被《Science》评为十大科技突破之一，2017年，又被《Nature Methods》评为生命科学领域的年度技术（Method of the Year 2017）。

荷兰科学家Hans Clevers教授是类器官世枝研究领域国际公认的先驱和鼻祖，早在2009年，Hans Clevers就发现Lgr5蛋白是肠道干细胞的标志物，并成功建立了首个肠道干细胞体外3D类器官培养体系，开创了类器官作为疾病模型的研究时代。

目前，类虚返消器官在生命科学研究中应用广泛，通过改变不同类器官的基因可以极大地帮助研究生物学过程和疾病建模。然而，由于缺乏简单的基因组工程方法，基因组编辑人类类器官的构建比较困难。

CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA可被看作病毒或外源DNA，得到精确编辑。

在2020年3月份，HansClevers研究团队在《Nature Cell Biology》杂志上发表学术论文《Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing》。

其利用非同源依赖的CRISPR-Cas9技术，可快速高效地对人源类器官进行基因敲入，他们将该技术命名为CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台。

研究人员利用这种新方法分析了肝细胞如何分裂以及DNA过多异常肝细胞是如何出现的，并发现敲除癌症基因TP53，异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁。以上发现或有助于深入研究相关癌症的发展过程。

研究者们为了印证CRISPR–HOT技术在人源类器官中进行基因敲入的方法可行，首先在两种难以转染的人源类器官（肝脏导管类器官及肝细胞类器官）进行测试，并对两种不同介导方式的基因敲入技术产生的类器官进行对比分析。

图示： HDR与NHEJ的技术路线以及优劣比较

结果发现，虽然抑制TP53的活性之后，HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低。Hans Clevers研究组的工作用CRISPR-HOT方法，建立了不依赖于对TP53活性抑制的以NHEJ介导的基因编辑技术，简化了基因敲入的流程，对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。

2020年11月，Hans Clevers研究团队又在《Nature Protocols》杂志发表学术论文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》，阐述利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究人类胎儿肝细胞作为类器官长期扩增的培养条件。

在文章中，作者提出：针对人类胎儿肝细胞和人类肝导管类器官的基因组编辑需要两种不同的实验程序。对于人类胎儿肝细胞类器官，采用基于电转杯电转染的转染策略。为此，类器官必须分解成单细胞或小块细胞，建议从第5代及以后开始对肝细胞类器官进行基因组工程设计，肝细胞类器官电穿孔的能力通常不会随时间而降低，作者已经成功地对人胎儿肝细胞类器官进行了基因组工程，差知可以做到至少第50代为止。

图示：人类胎儿肝细胞类器官的基因组 工程技术概略图

(采用电转杯电转染)

相反，对于人肝导管类器官，转染步骤是对完整的类器官进行的，是一种离体组织电转染的方式。

图示：人类肝脏导管类器官的基因组工程技术概略图

(采用离体组织电转染)

另外针对不同的基因编辑方式（Knock in和Knock out），作者也分享了非常详细的应对策略（见下图）。

俗话说，工欲善其事，必先利其器。那么在Hans Clevers研究团队深耕的类器官领域中，属于他们的一把利器是什么呢？我们发现，在大牛们的研究过程当中，对细胞的转染操作贯穿其中。而NEPA GENE的 NEPA21基因高效转染系统 正是他们所选用的高效电转仪。

NEPA21 基本介绍

【1】采用全新设计的电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。

【2】不需要特殊转染试剂辅助，节省实验成本；电转程序中的各项参数实时可见、可调，特别适用于优化原代细胞、非常见细胞的电转参数。

NEPA21高效基因转染系统独有的电压衰减（Voltage Decay）设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵以及宫内胚胎等转染。

得益于NEPA21良好的应用体验，Hans Clevers利用其已在类器官领域取得了丰硕的研究成果。目前已有多篇应用文献，是Crispr/Cas9基因编辑的第一品牌电转系统。NEPE21——让细胞转染更简单、更Free。

Ⅵ CRISPR/Cas9 设计sgRNA

CRISPR/Cas9 系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统， 通过 RNA 介导特异性的切割外源遗传物质， 用以对抗入侵的病毒和质粒。利用 Cas9 来摧毁入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 系统， 可以在体外进行基因的编辑。

为了提高CRISPR/Cas9 的特异性，使用 Cas9 切口酶和一对 sgRNA，两个相近的切口造成 DNA 双链断裂， 诱导细胞发山旅生非同源末端连接修复， 造成目的基因的突变。

利用 CRISPR/Cas9 进行基因的编辑，首先要构建有效的 sgRNA。一般地，基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序，可以被 Cas9 蛋白特异性识别并切割的 20 个 nt。 而 PAM 序列的特征为 NGG（其中 N 为任意核苷酸）

01

****找敲除目的基因的外显子****

根据目的基因选择待敲除靶基因位点找出敲除目的基因的外显子。 首先在第一个起始密码子 ATG 之后的外显子中找出特异性高的上下游序列。以小鼠基因 Th 为例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 区，选择第二个外显子作为敲除位点。

02

****设计成对 sgRNA 序列****

打开网站 http://crispr.mit.e ，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列。一般推荐网站设计，因为网站可老槐以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生。当然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列。

设计成对的 sgRNA 序列。打开 Nickase analysis，如图所示，网站会给出多组成对 sgRNA 序列，如箭头所示，并且预测可能脱靶数。

03

****分析逗含凳成对 sgRNA 序列****

打开 http://www.oligoevaluator.com ，将 sgRNA 输入，点击 Calcute，得到基因分析。综合考虑 Tm（56~62）、GC content （45～60%） 及 secondary structure 来最终确定适宜的 sgRNA 序列，因此，高 score 的序列不一定是最佳序列。

如图，第一对 81 分的序列，Tm 值大于 62 度，而且存在稳定二级结构，所以并不推荐。所以应该从上述成对序列中继续寻找合适成对 sgRNA 序列。

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****根据找到的合适的 sgRNA 订购 oligo****

图为 U6 真核表达载体设计，Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。

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****关于 cas9 的几个注意事项****

Ⅶ 什么是CRISPR

CRISPR技术是一种简单而强大的基因组编辑工具。它使研究人员能够很容易地改变DNA序列和修改基因功能。它的许多潜在应用包括纠正遗传缺陷、治疗和防止疾病传播以及改良作物。然而，它的承诺也引起了伦理问题。

在流行用法中，“CRISPR”（发音为“crisper”）是“CRISPR-Cas9”的缩写。CRISPRs是DNA的特殊延伸。蛋白质Cas9（或“CRISPR相关”）是一种类似于一对分子剪刀的酶，能够切割DNA链。

CRISPR技术是根据细菌和古细菌（单细胞微生物领域）的自然防御机制改编而成的。这些生物体利用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白（包括Cas9）来抵御病毒和其他异物的攻击。他们这样做主要是通过切割和破坏外国侵略者的DNA。当这些成分被转移到其他更复杂的有机体中时，它允许对基因进行操作或“编辑”。

直到2017年，没有人真正知道这个过程是什么样子的。在2017年11月10日发表在《自然通讯》杂志上的一篇论文中，由金泽大学的Shibata Mikihiro和东京大学的Hiroshi Nishimasu领导的一个研究小组展示了CRISPR第一次运行时的样子。[一个惊人的新GIF显示CRISPR咀嚼DNA]

CRISPR-Cas9：关键玩家

CRISPRs：“CRISPR”代表“有规律间隔的短回文重复序列簇”。它是DNA的一个特殊区域，具有两个明显的特征：核苷酸重复序列和间隔序列的存在。核苷酸的重复序列——DNA的组成部分——分布在CRISPR区域。间隔序列是散布在这些重复序列中的DNA片段。

对于细菌来说，间隔序列是从先前攻击有机体的病毒中提取的。它们作为一个记忆库，使细菌能够识别病毒并抵御未来的攻击。

这是由食品配料公司Danisco的Rodolphe Barrangou和一组研究人员首次通过实验证明的。在2007年发表在《科学》杂志上的一篇论文中，研究人员以酸奶和其他乳制品培养物中常见的嗜热链球菌为模型。他们观察到，病毒攻击后，新的间隔蛋白被整合到CRISPR区域。此外，这些间隔区的DNA序列与病毒基因组的部分序列相同。他们还通过取出或核腔派放入新的病毒DNA序列来操纵间隔区。通过这种方式，他们能够改变细菌对特定病毒攻击的抵抗力。因此，研究人员证实了CRISPR在调节细菌免疫中的作用。

CRISPR RNA（crRNA）：一旦一个间隔基被结合并且病毒再次攻击，CRISPR的一部分被转录并加工成crisprrna或“crRNA”。CRISPR的核苷酸序列作为模板产生互补的单链RNA序列。根据Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2014年发表在《科学》杂志上的一篇评论，每个crRNA由一个核苷酸重复序列和一个间隔部分组成。

Cas9：Cas9蛋白是一种切割外来DNA的酶。

该蛋白通常与两个RNA分子结合：crRNA和另一个称为tracrRNA（或“反式激活crRNA”）。两人随后将Cas9引导至目标地点，在那里进行切割。这片DNA是对crRNA的20个核苷酸延伸的补充。

使用两个独立的区域，或其结构上的“域”，Cas9切割DNA双螺旋的两条链，使所谓的“双链断裂”，根据2014年的科学文章。

有一个内置的安全机制，它确保Cas9不会在基因组中的任何地方被切断。已知短DNA序列s-PAMs（“邻近原间隔基序”）作为标记，与目标DNA序列相邻。如果Cas9复合物的目标DNA序列旁边没有PAM，它就不会被切割。根据《自然生物技术》（Nature Biotechnology）2014年发表的一篇评论圆握，这可能是Cas9从未攻击细菌CRISPR区的一个原因。

CRISPR-Cas9作为基因组编辑工具

不同生物体的基因组在其DNA序列中编码一系列信息和指令。基因组编辑包括改变这些序列，从而改变信息。这可以通过在改贺DNA中插入一个切口或一个断裂，并诱骗细胞的自然DNA修复机制来引入人们想要的改变来实现。CRISPR-Cas9提供了一种方法。

在2012年，两篇关键的研究论文发表在《科学》和《国家科学院学报》上，这两篇论文帮助细菌CRISPR-Cas9转化为一个简单的、可编程的基因组编辑工具。

这项研究由不同的小组进行，结论：Cas9可以直接切割DNA的任何区域。这可以通过简单地改变crRNA的核苷酸序列来实现，crRNA与互补的DNA靶点结合。在2012年的《科学》文章中，Martin Jinek和他的同事们进一步简化了这个系统，将crRNA和tracrRNA融合在一起形成一个单一的“导向RNA”。因此，基因组编辑只需要两个组成部分：导向RNA和Cas9蛋白。

，哈佛医学院遗传学教授乔治·丘奇说：“你设计了一段20个核苷酸碱基对，它们与你想要编辑的基因相匹配。”。构建了与这20对碱基互补的RNA分子。丘奇强调了确保核苷酸序列只在目标基因中发现，而在基因组中没有其他发现的重要性。”然后，RNA加上蛋白质[Cas9]会像剪刀一样在那个位置切割DNA，理想情况下是在别的地方，“他解释道，”一旦DNA被切割，细胞的自然修复机制就会启动，并将突变或其他变化引入基因组。这有两种可能发生的方式。根据斯坦福大学的亨廷顿外展项目，一种修复方法是将两个切口粘在一起。这种被称为“非同源末端连接”的方法容易引入错误。核苷酸意外插入或删除，导致突变，从而破坏基因。在第二种方法中，通过用核苷酸序列填充间隙来固定断裂。为了做到这一点，细胞使用短链DNA作为模板。科学家可以提供他们选择的DNA模板，从而写入他们想要的任何基因，或纠正突变。

实用性和局限性

CRISPR-Cas9近年来变得流行起来。Church指出，这项技术易于使用，其效率大约是之前最好的基因组编辑工具（称为TALENS）的四倍，美国麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的丘奇和张峰实验室的研究人员首次发表了在实验环境中使用CRISPR-Cas9编辑人体细胞的报告。利用人类疾病的体外（实验室）和动物模型进行的研究表明，该技术可以有效地纠正遗传缺陷。根据《自然生物技术》杂志2016年发表的一篇评论文章，此类疾病的例子包括囊性纤维化、白内障和范科尼贫血。这些研究为人类的治疗应用铺平了道路。

“我认为公众对CRISPR的认识非常集中于临床上使用基因编辑治疗疾病的想法，”纽约基因组中心的内维尔·桑贾纳和纽约大学生物、神经科学和生理学助理教授说这无疑是一个令人兴奋的可能性，但这只是一小部分。

CRISPR技术也被应用于食品和农业工业，以设计益生菌培养物和疫苗食用工业培养物（例如酸奶）以防病毒。它还被用于提高作物的产量、耐旱性和营养特性。

另一个潜在的应用是创造基因驱动。这些是遗传系统，它增加了一个特殊的性状从父母传给后代的机会。最终，根据Wyss研究所的研究，这种特性会在几代人中传播到整个群体。根据2016年《自然生物技术》的文章，基因驱动可以通过增强疾病载体（雌性冈比亚按蚊）的不育性来帮助控制疟疾等疾病的传播。此外，根据Kenh Oye及其同事在2014年发表在《科学》杂志上的一篇文章，基因驱动也可用于根除入侵物种，逆转对杀虫剂和除草剂的抗性，Church告诉Live Science：“CRISPR-Cas9并非没有缺点，

”

“我认为CRISPR最大的局限是它没有百分之百的效率。”。此外，基因组编辑效率可能会有所不同。根据Doudna和Charpentier在2014年发表的一篇科学文章，在一项在水稻上进行的研究中，接受Cas9 RNA复合物的细胞中，近50%发生了基因编辑。然而，其他的分析表明，根据目标，编辑效率可以达到80%或更高。

也有“目标外效应”的现象，即DNA在目标以外的位置被切割。这可能导致意外突变的引入。此外，丘奇还指出，即使系统按目标进行了削减，也有可能得不到精确的编辑。他称之为“基因组破坏”。

设定了

CRISPR技术的许多潜在应用提出了关于篡改基因组的伦理价值和后果的问题。

在2014年的科学文章中，Oye和同事们指出了使用基因驱动器的潜在生态影响。一个引进的性状可以通过杂交从目标群体传播到其他有机体。基因驱动也会降低目标群体的遗传多样性。

对人类胚胎和生殖细胞（如 *** 和卵子）进行基因修饰被称为生殖系编辑。由于这些细胞的变化可以遗传给下一代，使用CRISPR技术进行生殖系编辑已经引起了许多伦理问题。

的可变功效、偏离目标的效果和不精确的编辑都会带来安全风险。此外，还有许多科学界尚不清楚的问题。在2015年发表在《科学》杂志上的一篇文章中，大卫巴尔的摩和一组科学家、伦理学家和法律专家指出，生殖系编辑增加了对后代产生意外后果的可能性，“因为我们对人类遗传学、基因与环境相互作用的知识有限，以及疾病的途径（包括一种疾病与同一病人的其他情况或疾病之间的相互作用）。

其他伦理问题更为微妙。我们是否应该在未经后代同意的情况下，做出可能从根本上影响后代的改变？如果使用生殖系编辑从一种治疗工具转变为一种增强工具，以适应各种人类特征，会怎么样？

为了解决这些问题，国家科学、工程和医学院编写了一份全面的报告，其中包括基因组编辑的指导方针和建议。

尽管国家科学院敦促谨慎从事生殖系编辑，他们强调“谨慎并不意味着禁止”，他们建议只在导致严重疾病的基因上进行生殖系编辑，并且只有在没有其他合理的治疗方法的情况下才进行。在其他标准中，他们强调需要有关于健康风险和益处的数据，以及在临床试验期间需要持续监督。他们也推荐

最近的研究

最近有许多基于CRISPR的研究项目生物化学家和CRISPR专家萨姆·斯特恩伯格（Sam Sternberg）说：“由于CRISPR，基础研究发现的速度已经爆炸了。”他是加利福尼亚州伯克利市Caribou Biosciences Inc.的技术开发小组负责人，该公司正在开发基于CRISPR的医药、农业解决方案，以及生物研究。

这里是一些最新的发现：

在2017年4月，一个研究小组在《科学》杂志上发表了一项研究，他们编写了CRISPR分子程序，在血清、尿液和唾液中发现寨卡病毒株。2017年8月2日，科学家在《自然》杂志上披露，他们已经成功使用CRISPR去除了胚胎中的心脏病缺陷。2018年1月2日，研究人员宣布，他们可能能够阻止真菌和其他威胁巧克力生产的问题，使用CRISPR使植物更具抗病性。根据《生物新闻》（BioNews）杂志发表的研究报告，2018年4月16日，研究人员将CRISPR升级为一次编辑数千个基因。”

“Live Science contributor Alina Bradford的附加报告”

附加资源

Broad Institute:CRISPR基因工程和生物技术关键工作的时间表新闻：CRISPR-Cas9被合成核苷酸Broad Institute改进了10000倍：关于CRISP的问题和答案

Ⅷ CRISPRa基因过表达技术

上回说到，基因功能研究，最常用的策略就是功能获得和功能失活。基因过表达、基因干扰、基因敲除，这三板斧挥出去，配合下游的转录谱分析、表型分析，基因功能的神秘面纱，往往就能解开一角。

基因过表达技术，通常是指将目的基因的ORF构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因表达量增加的目的，可以使用的载体类型有Virus-Free转座子载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。

CRISPRa(转录激活)，作为基因过表达技术的新成员，是通过催化失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子，来实现促进基因组特定位点的转录。

目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募，成功将RNA表达水平提升了一个数量级。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因,研究显示，这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。他们发现，CRISPRa离转录起始位点越近，转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游（超过200bp），触发的转录就会更为温和，更接近生理水平。通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。

加州大学的Jonathan Weissman研究团队在dCas9上融合了一连串短肽（也就是SunTag array），这些短肽相当于一套分子挂钩，能在细胞中招募多拷贝的转录激活子，生成强劲的信号。

综合看CRISPRa（基因激活）系统是用于转录激活内源性基因的强大工具。完整的CRISPRa系统包含三个组分，每个组分分别由单独的载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。

gRNA/MS2表达载体，包括两个138-nt发夹RNA适体，形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些闭孝桥发夹RNA适体与gRNA连接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2，p65（NF-kB的反式激活亚基）和HSF1（人热休克因子1的激活结构域）组成的三结构域融合蛋白的表慎圆达。

dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式激活结构域融合蛋白的表达。

当这三种载体共转导细胞时，用户定制的gRNA可能会募集MS2/轿猛P65/HSF1（通过MS2结合发夹适体与gRNA连接）和dCas9/VP64（通过CRISPR/Cas9复合物组装） 到gRNA靶位点，从而组装出强大的SAM复合物。这些SAM复合物可通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同作用实现靶位点的强烈转录激活。

该载体系统可用于激活单个或一系列基因的转录，也可用于基因组的大规模筛选，使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。 

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.  

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi: 10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPR a vs ORF 传统过 表达 技术

相比于传统ORF稳转过表达技术，CRISPRa通过激活内源性启动子高效转录，从而促进基因表达，不需要额外构建外源性表达元件，不受基因转录本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技术在长转录本基因过表达研究、单基因多转录本的整体激活研究具有不可替代的优势。

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Ⅸ 如何提升crispr效率

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大多数植物基因组编辑研究利用来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-Cas9系统（SpCas9）。spCas9的识别依赖于特定的PAM序列NGG，这大大限制了该系统的编辑位点选择范围困启。为了解决这个问题，研究人员们从不同方向入手，寻找解决的办法。
2016年3月，中国水稻研究所王克剑课题组的研究人员通过对Cas9蛋白进行定点突变，获得了Cas9蛋白的VQR变体，并在水稻基因组中成功实现对NGA邻近序列的编辑，极大的扩展了基因编辑位点的选择范围（Hu et al.,2016）。然而CRISPR-Cas9-VQR系统与原CRISPR-Cas9系行尺桥统相比较，其编辑效率依然偏低，这限制了该系统在水稻中的推广应用。

2017年6月12日，王克剑团队与中科院遗传与发育生物学研究李家洋团队合作，在Plant Biotechnology Journal发表了题为“Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice”的文章( Hu et al.,2018)，通过优化sgRNA的结构以及使用水稻内源性强启动子来驱档猛动Cas9及VQR变体的表达，显着提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系统在水稻中的基因组编辑效率。通过试验，水稻中的编辑效率最高可达到近80%，提升幅度最高可达8倍。于此同时，该系统可以通过同位酶连接方式串联多个sgRNA同时进行多位点编辑（构建方法可参考王克剑团队王春博士2015年发表在Journal of Genetics and Genomics上的文章; Wang et al.,2015）。在多位点编辑时，效率提升幅度更加明显，可以达到15倍。因此，修饰后的CRISPR-Cas9-VQR系统将成为多NGA靶标位点编辑的强大工具。