⑴ 在植物学研究中使用分子标记应注意哪些问题
在植物学研究中使用分子标记应注意哪些问题
分子标记是以团棚羡个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学塌拍技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲和唤缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
⑵ SSR分子标记是怎样进行植物基因定位的
SSR分子标记是怎样进行植物基因定位的
在真核生物的基因组中,每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间笑仿差顷嫌异很大,因此形成其座位的多态性,并且每个SSR座位两端有一段保守的DNA序列,可以根据此保守序列设计引物,利用PCR技术进行扩增,然后用高浓度琼脂糖凝胶或变性聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分析.由于SSR多态性是由简单序列重复次数的差异引起的,因此在扩增的PCR带上会出现小片段或不连续的带.由此可见,SSR分子标记的基本原理就是要了解SSR座位两侧的核苷酸序列,寻找其中雀升手的特异保护区.
⑶ 怎么进行分子标记辅助育种
分子标记辅助育种(marker-aidedselection，MAS)常与基因工程育种并称为“分子育种”(molecularbreeding)MAS主要用于四个方面，即替代病害鉴定加快回交育种减少有害基因连锁和选择抗病QTL使用分子标记可以大大加快常规育种过程常用的分子标记以及MAS在抗病种质资源方面的应用，已在本书第十四章作了详细介绍
利用与抗病基因紧密连锁的分子标记，可以准确地鉴选具有主效抗病基因的植株，代替病原菌接种鉴定有些病害，难以利用病原菌接种鉴定，其原因是多方面的，有的因病原菌缺乏匹配无毒基因，有的因病原菌是检疫性有害生物而被限制使用，有的因接种鉴定受到环境条件或植物生育阶段的限制而无法实行，还有的因抗病性表达不明显不充分，难以得到明确结果在这些情况下，都可以利用分子标记鉴选抗病植株常规鉴定难以发现具有隐性抗病基因的个体，在涉及多个基因时，也难以由表现型判断植株具有的基因种类和数目，而检测团禅分子标记则易于做到使用共显性分子标记，可以直接区别抗病基因的纯合型和杂合型在累加或聚合多个抗病基因时，使用分子标记可以较容易而准确地检出多基因累加系
利用分子标记选择抗病单株可以在苗期或任何生育阶段进行，只要植株可以提供检测必需数量的DNA或蛋白质就可以进行，效率很高连锁的分子标记可以通过多种分子检测方法进行鉴定，应用PCR标记尤其经亮搭济简便使用分子标记筛选，代替传统的费力费时的表现型筛选，可以节省50%~70%的时间但由于成本较高，分子标记筛选现在还难以取代常规鉴定，用于大育种群体鉴定结果仍需经常规接种鉴定核塌键尘实
⑷ 如何将分子标记应用于作物育种的抗病育种
利用多种分子标记技术可以定位与植物抗病或发育有关的基因，然后可以将基因克隆出来之后转入对照植物，可以提高植物抗病抗逆或促进发育。
以分子标记技术在小麦条锈病抗病育种上的运用为例。
分子标记
在农业基础与应用研究领域，分子标记技术已开始应用于作物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很大的进展。
分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点:①在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。②数量多，遍及整个基因组。③有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以郑型在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。
目前，用于标记小麦抗叶锈病基因的分子标记主要有以下几种:
2.l RFLP技术在小麦抗叶锈病基因标记中的应用
RFLP(restriction fragment length polymorphism)作为遗传分析的工具开始于1974年，80年代开始应用于植物。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，产生相当多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA做探针把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱;它所代表的是基因组 DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。RFLP技术被广泛应用于小麦遗传图谱的构建标记和定位小麦的目的基因。
在小麦抗叶锈病基因的RFLP标记方面，SCHACHERMAYR等[8]将一编码受体蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段做宽用 PstⅠ分成六个亚片段，将这些亚片段作为RFLP标记，寻找到了特异的Lrk10片段可作为与小麦抗叶锈病基因Lr10紧密连锁的分子标记，将这一亚片段与已知抗性基因的单基因系进行Southern杂交，发现这一3.9Kb的HindⅢ片段仅存在于携带抗叶锈病基因Lr10的近等基因系中。进一步将此 RFLP标记Krkl0-6转变为STS标记STSLrkl0一6，发现一282bp的片纯丛亮段仅存在于携带Lr10的品种中，F2群体分离进一步证明此 282bp的片段与Lr10紧密连锁。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了与抗叶锈病基因Lr24紧密连锁的RFLP和RAPD的标记。在供试的115个RFLP探针中，其中6个与Lr24紧密连锁，从360个随机RAPD引物中，找到了11个能够揭示多态性的引物，其中一个与 Lr24紧密连锁，并将该RAPD产物克隆、测序将其转化为更为稳定可靠的STS标记，为分子标记辅助育种打下了良好的基础。FEUILLET等[10] 利用小麦抗叶锈病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品种Frisal，通过F2群体分离，将37个RFLP中的16个定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之间揭示多态性，I1个RFLP探针能在近等基因系间揭示多态性，F2群体分离分析发现，其中3个与抗性基因连锁，其中一定位在染色体5D上的探针pTAG621证明与Lr1紧密连锁，并将这一RFLP标记转化为了更为可靠的STS 标记。
AUTRIQUE[11]等利用4种含不同抗性基因的小麦近等基因系，根据抗性基因在其染色体上所处的位置选择克隆，同时，从大麦的RFLP连锁图谱和D一基因组RFLP图谱中，挑选了其它的克隆。通过杂交的方法来寻找多态性分子标记。结果发现，定位在染色体7DL和3DL上的8个分子标记，与抗性基因Lr19和Lr24共分离;来自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色体6B上，一克隆XksuD27与Lr9共分离，以及与Lr32紧密连锁的两个RFLP标记，遗传距离分别为(3.3土2.6)cM和(6.9土3.6)cM。
2.2 小麦抗叶锈病基因的RAPD标记
NAIK等[12]利用含Lr28的抗叶锈病近等基因系，从80个随机引物中找到了一个能在供体亲本和轮回亲本中揭示多态性的RAPD标记OPJ一 O1。将此387bp的多态性产物克隆、测序，将其设计成更为稳定的STS标记，利用BSA法，对F3群体进行分析，发现387bp的特异性产物只出现在抗性群体中，而在感病群体中表现缺失。证明了RAPD标记OPJ一O1和STS 标记均与Lr28紧密连锁。SIELDLER等[13]利用400个随机引物和14个DNA探针筛选近等基因系Lr9的多态性，并通过F2群体进行遗传连锁分析。结果表明2个RAPD标记和一个RFLP标记可以区分抗感品系,且与Lr9紧密连锁。WILLIAM等[14]利用RAPD技术，从400个随机引物中，找到了3个能在抗病群体和感病群体中揭示多态性的引物0PG-05、0P1-16和OPR-03，将其克隆转化成探针后，对重组群体进行 Southern杂交，确定其中前两个探针与持久抗叶锈病基因相关的数量性状位点(QTL)紧密连锁，其中定位在7BL上的QTL与抗叶锈病基因Lr34 部分同源。SCHACHERMAYR等[15]从395个随机引物中筛选出了3个与小麦抗叶锈病基因Lr9连锁的RAPD标记，将其特异性产物克隆、测序，然后转化成更为稳定的STS标记，F2、F3分离群体检测发现，所有的3个RAPD标记0PA-07、0PJ-l3、OPR-15和一RFLP标记 cMWG684与Lr9紧密连锁。另一RFLP标记PSR546也与Lr9紧密连锁，并与上述四个
DNA标记紧密连锁，遗传距离为(8士2.4)cM，此标记被定位在小麦染色体长臂6BL上。DEDRYVER等[16]利用含Lr24的小麦抗叶锈病近等基因系，在125个随机引物中，只有引物OP-H5能在抗病亲本RL6064中扩
增出一700bp的特异性的条带，而在感病亲本Thatcher中没有。F2群体分离证明，该标记与Lr24完全连锁。将其转变成稳定、可靠的SCAR标记，为分子标记辅助育种提供了有力的工具。
3 其它分子标记
虽然RFLP和RAPD是两种比较普遍的分子标记，但RFLP在小麦中检测的多态性较低，仅为20%--38%。RAPD是方便经济的分子标记，但是重复性和稳定性较差。其它的分子标记，如SSR、ISSR和AFLP的综合信息量大，在作物特别是小麦遗传资源的研究上有着广阔的应用前景。
4 分子标记辅助选择
目前，分子标记技术已开始应用于育种实践，并表现出其独特的优越性。寻找与重要的农艺性状紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择(又称分子育种)和通过作图克隆基因的基础。分子标记辅助选择(Molecular-assisted-selection简称MAS)是生物技术与传统遗传育种相结合而形成的，它可以减少传统的回交育种过程中很难消除的连锁累赘，还可以把不同抗叶锈病基因聚合到同一优良品种中，实现同效基因的累加作用，获得持久抗性。在获得稳定的分子标记的基础上，通过染色体步行(Chromosome walking)等方法分离克隆该基因。
由于分子标记育种技术目前尚不成熟和完善，因此还不能作为一种育种方法单独使用。我国传统育种经验丰富，因此，应注意将分子标记这一先进技术与育种家的丰富经验相结合，使分子标记辅助选择发挥其更大的作用。
⑸ 植物分子系统学研究的常用技术和方法有哪些
网上找到的
常用技术方法
(一)同位素标记法
同位素用于追踪物质的运行和变化规律。用示踪元素标记的化合物，化学性质不会改春迟唯变。人们可以根据这种化合物的放射性，对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学研究方法叫做同位素标记法，也叫同位素示踪法。
可用于研究旦皮细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。如3H、14C、15N、18O、32P、35S等。
1. 科学家利用“同位素标记法”弄清了许多化学反应的详细过程．下列说法正确的是
A．用14C标记扒培CO2最终探明了CO2中碳元素在光合作用中的转移途径
B．用18O标记H2O和CO2有力地证明了CO2是光合作用的原料
C．用15N标记核苷酸弄清了分裂期染色体形态和数目的变化规律
D．用35S标记噬菌体的DNA并以此侵染细菌证明了DNA是遗传物质 A
（二）荧光标记法。
同位素标记法和荧光标记法的区别：同位素标记法通常采用放射性同位素标记物质中的分子原子，荧光标记法通常是借助荧光分子来标记蛋白质。一个是元素标记，另一个是分子标记。
2.现代分子生物学采用的测定基因在染色体上位置的方法是
A.杂交法 B.测交法 C.荧光标记法 D.X射线衍射法 C
（三）差速离心法
用高速离心机在不同的转速下进行离心，利用不同的离心速度所产生的不同离心力，就能将各种细胞细胞分开
（四）分子杂交技术：
根据某些物质分子之间特异性识别和结合的性质，利用已有的物质分子对未知物质分子进行检测的技术。
3. 用某人的胰岛素基因制成的DNA探针，检测下列物质，不能形成杂交分子的是，
A．该人胰岛A细胞中的DNA B．该人胰岛B细胞的Mrna C．该人胰岛A细胞的mRNA D．该人肝细胞的DNA C
二．科学研究方法
（一）类比推理
根据两个对象之间有某些性质相同，从而推测它们的其他性质也相同的方法。应当注意的是，类比推理的结论具有偶然性，可能是正确的，也可能是错误的，其证实或证伪还需要通过观察或实验。
⑹ 分子标记在辣椒种质资源研究上的应用是怎样的
“七五”以来，中国辣椒常规育种特别是杂种优势利用取得了很大的成功，中椒、湘研、苏椒和甜杂等系列F1代已成为商品椒生产的主栽品种。然而，和其他作物育种一样，目前辣椒育种的瓶颈是育种材料狭窄的遗传背景。辣椒有丰富的遗传资源，但被育种家利用的材料只是极少数。中国对辣椒种质资源的研究大多限于植物学性状和园艺性状的观察，没有系统地对这些种质资源进行鉴定和分类，更没有有效地利用野生、半野生种质资源的有益基因对现有自交系进行改良或创新。分子标记是20世纪80年代发展起来的遗传分析技术，目前在美、法、以、韩等国已经被广泛用于辣椒种质资源的分类和鉴定。许多重要质量性状的分子标记辅助育种已经达到应用阶段。分子标记连锁遗传图谱为复杂的数量性状的改良和创新提供了蓝图。
一、种质资源的鉴定和分李谈扮类
用分子标记技术可以快速构建种质资源的指纹图谱，为种质资源的鉴定和分类、优异种质资源的知识产权保护、核心种质库的构建提供更加客观的依据。
（一）辣椒属Capsicum frutescens和C.chinense的鉴定
Capsicum frutescens和C.chinense形态相似。在辣椒属分类学中一个长期的争论是：C. frutescens和C.chinense究竟是两个不同的物种还是同一个种里的两个不同类型。通过RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）标记分析，美国新墨西哥州立大学的研究者发现C.frutescens的品系间平均遗传相似系数为0.85，C.chinense的品系间平均遗传相似系数为0.80，而C. frutescens和C.chinense的平均遗传相似系数仅为0.38（Bl and Bosland，2004）。根据这一有力的证据，并结合两者形态学性状的差异及杂交后代的育性降低等事实，他们认定C. frutescens和C.chinense是辣椒属里两个不同的物种。
（二）栽培辣椒起源中心和次生中心的遗传多样性比较
栽培辣椒（C.annuum var.annuum）起源于墨西哥，15世纪被航海家哥伦布带到欧洲，后来传到亚洲和非洲。亚洲、中南欧和非洲被认为是辣椒的次生中心。辣椒在尼泊尔被广泛栽培，当地农民保存了数量繁多的地方品系。RAPD标记聚类分析表明在遗传相似系数设定为0.80时，所有尼泊尔的地方品系均分在同一组，而墨西哥的品系则可以分为8个不同的组（Bl and Bosland，2002）。这表明由于洲际迁移，尼泊尔的辣椒群体经过了一个进化的瓶颈而具有很窄的遗传背景。中国湖南、云南、四川和陕西等省也有很多地方品系侍脊，是中国辣椒育种的主要遗传材料。尼泊尔的案例应该对中国辣椒种质资源研究有启发作用，即在采集具有中国特色辣椒种质资源的同时，应该更重视辣椒起源中心墨西哥种质资源的收集，因为起源中心有更为丰富的基因库。
二、辣椒分子标记遗传图谱
遗传图谱是遗传育种研究的基础工具，是挖掘种质资源中有益基因特别是数量性状基因的蓝图。在分子标记诞生以前，只有玉米和番茄等极少数作物有较完备的遗传图谱。分子标记的诞生为遗传图谱的构建提供了极大的方便。辣椒分子遗传图谱的建立得益于其和番茄这一模式作物的亲源性。番茄—辣椒的比较遗传学研究表明：虽然辣椒的基因组进化经历了较大的重组，导致辣椒的基因组比番茄大3～4倍且基因的排列顺序差别很大，这两种茄科作物却有极其相似的基因内容。所有测试过的番茄cDNA探针都能与辣椒基因组DNA杂交（Tanksley et al.，1988）。应用这些探针的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）标记构成了辣椒分子遗传图谱的骨架。到目前为止研究者已经发表了10幅辣椒分子遗传图谱，但最具代表性的是美国康乃尔大学和法国农业科学院发表的两幅图谱。
康乃尔大学图谱（CU-Map）所用的群体是C.annuum×C.chinense的种间杂交F2代群体。此哪灶图谱包括11个大连锁群（76.2～192.3cM）和2个小连锁群（19.1和12.5cM），总共覆盖1245.7cM的基因组。Jahn博士领导的辣椒遗传育种实验室利用来自于番茄的RFLP标记探针对番茄和辣椒的基因组作了系统的比较遗传学研究。结果表明两者之间有18个同源连锁片段，涵盖了番茄基因组的98.1%和辣椒基因组的95%。通过这幅图谱以及马铃薯的图谱，他们确定了造成这3个重要茄科作物进化史上分化的染色体重组的类型和次数，并重建了这3者共同祖先的理论图谱。这些染色体重组包括5次易位、10次臂内倒位、2次臂间倒位以及4次染色体的分离/缔合。在作图群体的两个亲本之间也存在3次染色体重组。CU-MAP共标定了677个包括RFLP，RAPD，AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）以及同工酶标记，平均每1.8cM就有1个标记。但是由于标记在染色体上的分布不是均匀的，54%的标记集中在着丝点附近，使得CU-MAP的骨架图谱的标记密度是9cM/标记（Livingstone et al.，1999）。对于辣椒来说这种标记密度已经是理想的了。
法国农业科学院图谱（INRA-MAP）所用的3个群体都是C.annuum种内杂交群体，其中有两个DH（Doubled Haploid，加倍单倍体）群体（HV-H3×Vania和PY-Perennial×Yolo Wonder）和一个F2群体（YC-Yolo Wonder×Criollo de Morelos 334）。因为常规育种所应用的种质资源主要来源于C.annuum，种内杂交图谱能更好地用于分析育种实际使用的基因库，能直接提供分子标记为育种服务。例如，这3个群体都有一个亲本对CMV和疫病有部分抗性，而另外一个亲本则对这两种重要病害高感。HV和PY是DH群体，属于永久群体，可以多次重复多年多点观察各种数量性状的遗传。以Palloix博士为首的法国农业科学院辣椒育种小组也准备将YC群体转化为永久性的RIL（Recombinant Inbred Lines，重组自交系即单粒传后代）群体，以便于研究疫病抗性这一重要的数量性状（Palloix，个人通讯）。共有543、630和208个标记位点（包括RFLP，RAPD，AFLP，PCR，同工酶及形态学标记）被标定在HV、PY和YC图谱上。通过整合这3幅图谱，他们绘出了含有12个大连锁群的整合图谱，和辣椒单倍体的染色体数目相吻合，并和CU-MAP的研究结果相似，这个整合图谱和番茄图谱之间相互关系非常复杂（Lefebvre et al.，2002）。
一批控制园艺性状的基因或数量性状位点（Quantitative trait locus，QTL），如抗病性、熟性、雄不育、辣味、果色、果重和果形指数等，已经被定位在分子标记遗传图谱上（表26-1）。这为通过分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）对多个性状进行种质资源的改良和创新提供了条件。
表26-1 辣椒已定位的基因或数量性状位点
表26-1 辣椒已定位的基因或数量性状位点（续）-1
三、种质资源改良和创新中的分子辅助筛选
对种质资源中有益基因的利用存在新旧两种模式：表型选择法和基因选择法（Tanksley and McCouch，1997）。表型选择法对于有单基因控制性状的育种是成功的，如辣椒抗根结线虫育种等。但是由于受性状鉴定的条件限制，表型选择法只能操作数量有限的基因。对于辣椒的大部分重要数量性园艺性状，如产量、抗CMV、抗疫病、果实性状等，表型选择法有很大的局限性，会漏掉很多有利的基因。基因选择法可以同时选择多个基因位点，可以在苗期进行选择，提高种质资源改良和创新（特别是遗传复杂的数量性状的改良）的效率和针对性。基因选择法需有两个前提条件：一是覆盖度高、密度较高的分子标记遗传图谱；二是标定在此图谱上的需选择的基因和数量性状位点。下面通过3个例子说明基因选择法在种质资源改良和创新上的应用。
（一）核质互作雄性不育恢复基因
辣椒质核互作不育（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）可以提高杂交制种的效率和纯度，在生产上很有前途。CMS中育性恢复由主效和微效基因共同控制，且受到环境条件如温度的影响。恢复系在辣椒中可以找到，但在大果形甜椒中则没有。在向大果形甜椒中转育恢复基因的过程中，需要通过和不育系测交才能确定恢复基因的存在。研究表明通过表型选择法来创造大果形甜椒恢复系非常困难。中国农业科学院蔬菜花卉所辣椒育种组利用21号牛角椒（rfrf）和湘潭晚（RfRf）的F2群体筛选了和主效恢复基因Rf连锁的分子标记（Zhang et al.，2000）。两个RAPD标记和Rf连锁：OP131400离这一主效基因仅0.34cM；OW19800位于Rf的另一侧，遗传距离为8.12cM。供试的甜椒品种均没有这两个标记，这两个标记可以用于将辣椒的主效育性恢复基因转移到甜椒中去。
和法国农业科学院合作，该课题组将育性恢复作为数量性状定位在以Perennial（RfRf）×Yolo Wonder（rfrf）双单倍体群体构建的分子标记遗传图谱上（Wang et al.，2004）。主效恢复基因被定位在辣椒6号染色体上，并定位了4个微效基因。其中一个微效基因被定位在2号染色体上，并和控制辣味的基因（Pun1）紧密连锁，这解释了为什么辣椒品系恢复系频率更高。同时发现保持系Yolo Wonder也有可提高育性恢复的微效基因，这表明育性恢复有超亲优势。这些结果对于创造高不育度的不育系和高恢复度的恢复系有很大的指导意义。
（二）抗黄瓜花叶病毒（CMV）
CMV在辣椒上能产生严重的花叶症状、导致叶片变形扭曲和并能损害果实的商品性状，是辣椒最严重的病害之一。CMV抗性是典型的数量性状，至今没有发现一份材料对CMV有完全的抗性。但部分抗性在栽培辣椒的野生品系和近缘野生种中时有发现。这些材料对CMV的抗性或耐性机制主要有3种：①抑制病毒侵入寄主细胞；②抑制病毒的繁殖；③抑制病毒的移动。另外中国CMV抗源材料二斧头中还有另外一种CMV耐性机制，即感病后能够恢复（Palloix，个人通讯）。把控制这些抗性机制的基因通过育种叠加在一起是获得高抗品种的必然途径。
Cnta等将Perennial上的抑制病毒侵入的QTL定位在3号和12号染色体上。8号染色体的TG66位点本身不提供抗性，但和12号染色体上的QTL有上位互作。这3个位点共解释57%的表型变异（Cnta et al.，1997）。甜椒自交系Vania能部分地抑制病毒的长距离移动，这种抗性主要由12号染色体上的主效QTL-cmv12.1提供。取决于表型鉴定的方法，该QTL解释45%～63.6%的表型变异（Cnta et al.，2002；Parrella et al.，2002）。Palloix等观察到，Vania抵抗病毒侵入的能力很低，但却有较高的抑制病毒移动的能力；而Perennial正好相反。育种结果表明综合这两种不同抗病机制的QTL的材料有很大的超亲优势（Palloix，个人通讯）。
Ben Chaim等将Perennial中另一个抗CMV的QTL-cmv11.1定位在第11号染色体上。该QTL和抗TMV基因L连锁，但处于排斥相，这解释了在Perennial中CMV抗病性和TMV感病性是相关的。Perennial上，其3、4、8号染色体上的抗CMV的QTL和控制果重的QTL fw3.2、fw4.1及fw8.1连锁。这样在回交过程中，Perennial的小果重QTL就会随着抗CMV的QTL一起被导入到轮回亲本中（Ben Chaim et al.，2001）。要打破这种连锁累赘，必须用分子标记精确地定位这些紧密连锁的QTL并在较大的回交群体中筛选重组植株。
（三）抗疫病
疫病是辣椒最严重的土传病害，目前国际辣椒育种界公认抗病性最强的材料是来自于墨西哥的小果形地方品种Criollo de Morelos 334（CM334）。法国农业科学院Palloix小组对这份抗源作了细致的研究，确定了6个QTL：Phyto.4.1、Phyto.5.1、Phyto.5.2、Phyto.6.1、Phyto.11.1和Phyto.12.1（Thabuis et al.，2003；2004）。其中Phyto.5.1和Phyto.5.2也存在于其他辣椒品系中如Perennial和H3等。Phyto5.2现在可以通过一个紧密连锁的PCR标记D04来辅助选择（Quirin et al.，2005）。
CM334现已被各国育种研究机构和种子公司广泛用于抗疫病种质资源的改良或商业育种。Thabuis等人（2004）利用分子标记比较了不同轮回育种方案在转育CM334抗病性时的效率，发现在高选择压力时的抗病QTL不易丢掉。经过多年的努力，Palloix小组已经育成了疫病抗性较强的优异甜椒品种（个人通讯）。这些材料的引进为快速提高中国抗疫病育种的水平提供了机会。
在“七五”至“九五”期间的快速发展以后，中国辣椒育种目前又面临新的瓶颈。这主要是由于辣椒种质资源的收集、鉴定、改良和创新的力度不够，导致育种研究后继乏力。由于辣椒转基因很困难，这使得分子标记辅助育种成为提高育种效率的重要生物技术手段。然而除了核质互作雄不育恢复以外，分子标记技术尚未在中国辣椒遗传研究中发挥其作用。为了加强分子标记技术在辣椒育种和种质资源利用上的研究，人们仍然有很多基础工作要做，包括通过分子标记建立中国辣椒核心种质资源库、建立分子标记遗传图谱、重要性状的分子遗传机理研究、分子标记辅助育种的实用化等。这些工作的实施，需要借鉴美、法、以等国先进的研究成果，需要密切关注其他茄科作物如番茄、马铃薯和烟草基因组学的最新进展，更需要国内从事辣椒种质资源研究、分子生物学研究和育种研究单位的通力合作以及可共享的创新研究体系的建立。
⑺ 西瓜的分子标记技术是怎样的
近年来，随着分子生物学的发展，直接在DNA水平上进行基因组差异分析的技术（RAPD、RFLP等）越来越受到重视。与蛋白质和同工酶分析相比，DNA分析的方法更能直接反映出研究对象的遗传信息，准确率高，稳定性好，目前，已广泛用于西瓜遗传基础的研究。
（一）遗传图谱的构建
Hashizume等（1996）利用一个近交系（H-7；C.lanatus）和一个野生类型（SA-1；C.lanatus）杂交获得的BC1群体构建了一个最初的西瓜分子遗传连锁图谱，该图谱包括58个RAPD标记，1个同工酶标记，1个RFLP标记和2个形态标记，分为11个连锁群，全长524cM。张仁兵等（2000）利用97103×PI296341杂交的F2群体构建了一个分子遗传图谱，包括85个RAPD标记，3个SSR标记，3个同工酶标记，4个形态标记及1个抗枯萎病生理小种1基因，覆盖基因组长度为1203.2cM。Hawkins等（2001）利用F2和F3群体构建了两张西瓜连锁图谱，分别包括26和13个标记（同工酶、RAPD、SSR），分布在2个和5个连锁毕余群上、覆盖基因组长度分别为112.9cM和139cM。Levi等（2001）利用BC1群体[（PI296341-FR×NKM）×NKM（New Hampshire Midget）]构建了长达1295cM的遗传连锁图谱，包括155个RAPD标记和1个SCAR标记，分为17个连锁群，而后Levi等又利用一个测交群体构建了包括141个RAPD标记、27个ISSR标记和1个SCAR标记的分子遗传图谱，分为25个连锁群，全长1162.2cM。范敏等（2000）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341杂交所得F2的118个单株为作图群体，构建分子连锁图谱，定位了影响西瓜果实可溶性固形物含量的4个数量性状位点（QTL），果皮硬度的5个QTL，果皮厚度的2个QTL，单瓜重的3个位点，种子千粒重的6个位点。
然而，利用BC1或F2等非永久群体所构建的分子遗传图谱，无法继续将其饱和，难以准确地对其进行重要农艺性状的QTL定位，同时也无法与其他实验室合作进行比较研究。因此，采用永久群体如重组自交系与DH（单倍体加倍）群体进行分子遗传图谱的构建已经成为目前国际上图谱构建的主流方向。由于西瓜花药与小孢子培养比较困难，利用重组自交系来构建西瓜永久分子遗传图谱可能成为最有效的选择。张仁兵等（2003）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341杂交所得重组自交系F8的117个单株为作图群体，利用RAPD标记技术构建了西瓜分子遗传图谱。该图谱包含87个RAPD标记、13个ISSR标记和4个SCAR标记，分为15个连锁群，包括：1个最大的含31个标记的连锁群（277.5cM）、6个大的含4～12个标记的连锁群（51.7～172.2cM）和8个小的含2～5个标记的连锁群（7.9～46.4cM），覆盖基因组长度为1027.5cM，两个标记间的平均距离斗启为11.54cM。该图谱为以后获得饱和的分子遗传图谱、重要农艺性状的QTL分析以及图谱克隆抗病基因奠定了坚实的基础。
西瓜是一种基因组小（约为4.3×105kb）、遗传差异狭窄的作物，以上分子标记主要是采用多态性较低、稳定性较差的RAPD标记，不能满足其分子遗传研究的需要。易克（2003）对97103×PI296341所获得的F8重组自交系群体，通过16个SSR和5个ISSR引物对该群体进行扩增，建立了一个包括38个SSR标记和10个ISSR标记组成的分子图谱，该图谱总长558.1cM，平均图距为11.9cM。易克（2004）又对97103×PI296341所获得的F2S7重组自交系群体，通过AFLP技术对该群体进行扩增，建立了一个包括150个标记组成的分子图谱，包括17个连锁群，覆盖基因组范围1240.2cM，两个标记间的平均图距为8.3cM。该图谱的建立对于西瓜高密度遗传图谱的构建、重要农艺性状的QTL定位以及重要基因的图谱克隆均具有重要的参考价值。
（二）遗传多样性及亲缘关系分析
西瓜的遗传背景相对狭窄，栽培种和野生种、种间多态性较高，品空数如种之间多态性较低。Zhang XP等（1994）对3份栽培品种、1份栽培种的野生类型材料和1份栽培种与野生种的杂交种进行RAPD检测，53个引物在5份材料中产生的多态性为62.3%，而在3个栽培品种内的多态性带仅为10.1%，其平均遗传距离为0.240～0.263cM。韩国的Lee SL等（1996）对39份西瓜材料进行RAPD检测与聚类分析，发现其平均遗传距离的变动范围仅为0～0.366。赵虎基等（1999）对西瓜的RAPD标记多态性研究表明：14个引物在12份材料间共扩增出114条带，其中有81条具多态性，占总条带的71.1%。其中一份饲用西瓜、3份食用西瓜和8份籽用西瓜之间带型差异较大，说明亲缘较远；8个籽瓜之间和3个食用西瓜之间带型差异较小，说明亲缘较近。
李严等（2005）利用SRAP（Sequence-Related Amplified Po1ymorphism）进行了西瓜杂交种遗传多态性的研究，利用25个多态性引物组合对当前生产上推广的20个西瓜杂交种进行扩增，从中筛选得到20个多态性引物组合，共产生135个多态性条带，平均每个引物组合产生7.11个多态性条带，显示了较高的多态性。聚类分析将20份材料分为3大类，Jaccard’s相似系数在0.29～0.86之间。
（三）杂种鉴定
欧阳新星等（1999）采用简化了的适合西瓜的RAPD-PCR分析程序，对无籽京欣1号西瓜种子纯度进行分子鉴定，找到了一个标记OPP01/564，其只在父本和杂交种上出现，母本中不出现，可用于鉴定该杂交种的品种纯度。
王鸣刚等（2003）以不同西瓜杂交种及亲本自交系为材料，研究利用RAPD技术鉴定西瓜杂种的纯度及种质的方法。结果表明：RAPD技术完全适合于西瓜杂交种纯度的早期鉴定及种质鉴定。引物OPD16及OPA07适合种内鉴定，而引物OPA10、OPA13、OPH18可用于杂种纯度鉴定。其中，引物OPA10/890（母本缺少）和OPA13/1140（母本缺少）、OPA13/750（父本缺少）可用来鉴定西农8号西瓜杂交种纯度；母本缺少的引物OPH03/350，OPH04/280和OPH18/620能用来鉴定兰州P2的杂交种纯度。
（四）分子标记辅助选择
许勇等（1998）运用RAPD技术进行了西瓜野生材料PI482322耐冷性基因的分子标记研究，找到了一个与耐冷基因连锁的分子标记OPG12/1950，其遗传距离为6.98cM。许勇等（1999）运用RAPD技术，采用混合分组分析（BSA）方法进行了西瓜野生种质PI296341抗枯萎病基因分子标记研究。结果表明：西瓜野生种质PI296341对枯萎病生理小种1的抗性由单显性基因控制，RAPD标记OPP01/700与其抗病基因连锁，其遗传距离为3.0cM。许勇等（2000）对RAPD标记OPP01/700进行了克隆、测序，Southern杂交证明此标记为单拷贝，并转化为SCAR标记。上述技术在抗病转育后代中得到了很好的应用，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择系统。
刘海河等（2004）利用RAPD技术对西瓜G17AB雄性不育系的不育株和可育株基因组DNA进行了比较分析，在31套621个RAPD引物中，有548个引物在两者之间获得扩增产物，筛选到了可育株与不育株的特异扩增条带A123K（分子量约为3.0kb，序列为5’-TCGGCGATAG-3’）片段，经多次重复验证，表现稳定的多态性。用该引物对单个不育株后代育性分离群体进行了RAPD分析，确定了A123K与育性基因的遗传距离为8.1cM。
张显等（2005）应用RAPD分子标记技术，采用BSA法对西瓜隐性核不育材料Se18的不育基因进行了分子标记研究。结果表明：在220个引物中，只有引物S1167（序列为ACCACCCGCT）、S357（序列为ACGCCAGTTC）在不育株DNA中扩增出了多态性特异片段，而在可育株DNA中未扩增出多态性片段。验证结果表明：引物S1167在12个不育材料中的138个不育株全部扩增出特异性片段，可以区分不育株与可育株。对特异性片段进行回收、克隆和测序结果表明，S1167扩增特异片段有2391个碱基对。