免疫组化技术如何运用

Ⅰ PCR技术与免疫组化技术的实际应用中的异同点

免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

Ⅱ 免疫组化怎样做

你是病理技术员吗？这个需要去进修的，不然不要尝试，浪费试剂不说，准确度堪忧

Ⅲ 免疫组化的操作步骤

1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2.缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注:孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。)

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育 20 分钟。

10 .缓冲液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ，在室温下孵育 30 分钟。

(注:HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

12 .缓冲液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

14 .自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

Ⅳ 免疫组化技术的介绍

免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

Ⅳ 免疫组化的用途，求专业人士解答。

由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水

由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。

1、确定细胞类型

通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞(如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞)光镜下不易辨认，但免疫组化标记(S-100蛋白等)能清楚显示其形态。

2、辨认细胞产物

利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。

3、了解分化程度

大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原(EMA)着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒;角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。

4、鉴定病变性质

通过标记Ig轻链(κ、λ)可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链(κ+/λ+)，后者常为多克隆Ig轻链(κ+、λ+)。而标记Bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达;而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达Bcl-2蛋白，而套细胞则表达。

5、发现微小转移灶

某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法(如用上皮性标志)则十分有助于微小(癌)转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。

6、探讨肿瘤起源或分化表型

一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源(可能来自神经鞘细胞)。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定来源。

7、确定肿瘤分期

判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。

8、指导治疗和预后

免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差;而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体(EGFR)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。

9、辅助疾病诊断和分类

人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型;胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种;恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。

10、寻找感染病因

人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒(CMV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乙型肝炎病毒(HBV)等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。

Ⅵ 免疫组化的作用是什么呢

由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰， 将研究推进到了基因水平。分子生物学洗涤剂 http://proct.bio1000.com/101184/

Ⅶ 免疫组化技术的前言

——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
—— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。
—— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细 胞化学得到广泛应用。
—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜 技术相继问世。
—— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的 一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。 （1）根据染色方式分成：① 贴片染色
② 漂浮染色
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：
① 直接法
② 间接法
③ 多层法
（3）按标记物的性质分成：
① 免疫荧光技术（免疫荧光法）
② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法）
③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate ，FITC） —— 荧光显微镜下 呈绿色荧光
四乙基罗达明（rho—damine RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光
② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③ 生物素：（Biotin）
④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用） 1．直接法
荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗 原。
△ 酶标抗体要显示后镜检。
直接法优点：简单，时间短，特异性强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用！
2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
※显色后镜检
特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。
3．非标记Ab桥法：
“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。
（1）单桥法
(2)双桥法
在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，
可增大染色强度。
★ 特别提示：注意动物种属关系
4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）
~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。
该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。
5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC 法）
Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。
Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。
ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。
（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理
6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色） Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase）
※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO 。
它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。
现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。
7．蛋白A—金法（Protein—A gold method）
~多用于电镜
8．双重组化染色法
应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。
9．免疫金—银染色法
（Immunogold—silver staining IGSS） 注意事项：
1．固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和
性能。
2．固定方式的选择：① 浸渍固定（参考文献）
② 灌注固定（+后固定）
③ 蒸汽固定 1．切片脱蜡入水，入PBS 洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 （在PAS或0.05Tris—HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室 温，30 分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。
5．滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。
6．0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，室温15′~ 60′。
8．0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。
10．0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB—H2O2 显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）
13．自来水洗净。
14．用Mayer 苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。 1．实验计划
① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。
③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）
（1）工作液：无须稀释
（2）原液：
① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；
若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。
② 原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。
③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。
④ 关于Ab保存应参照说明书。
（3）Ab浓度的选择
Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。
3．Ab滴片技术
—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要领：甩净组织周围的水。
4．PBS洗涤技术
（1）洗涤的目的
① 保证离子浓度和PH值。
② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
（2）方法：洗三次，每次5分钟。
5．Ab孵育技术
（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
（2）温度与时间 4℃：过夜；
37℃：2 h or 参考说明书
6．光镜控制显色方法
（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。
（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。 从以下几 个方面综合评价：
1．阳性染色特点
① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）
② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）
2．组织切片制作过程的影响
① 固定不良—非特异性染色，显示不均。
② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。
3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。
阳性对照：
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。
阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
▲ 染色失败的几种原因：
（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能：
① 染色未完全严格按照操作步骤进行；
② 漏加一种抗体，或抗体失效；
③ 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；
④ 底物中所加H2O2 量少或失效；
⑤ 复染或脱水剂使用不当
（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：
① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。
② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。
③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
④ 抗体温育的时间过长。
⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。
（3）所有切片背景过深，原因可能是：
① 未加酶消化处理切片。
② 切片或涂片过厚。
③ 漂洗不够。
④ 底物呈色反应过久。
⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗体稀释不够。
（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因是：标本的固定和处理不当。

Ⅷ 组织芯片技术在免疫组化及原位杂交阳性对照中如何应用拜托各位了 3Q

组织芯片技术其优点是可对大量的组织标本进行了各种检查，对肿瘤病理学、免疫学等研究具有可行性和可比性，同时有节省时间，节约成本的优点，对病理学研究 具有较多的优越性，如对各种组织起源的不同类型肿瘤进行免疫组织化学染色等研究，对各种抗体的敏感性及特异性的检测，因其实验条件的一致性，所以各种实验 结果的准确性、科学性、可比性[6-8]均有了保证。 免疫组织化学及原位杂交中的设立阳性对照是对免疫组化染色结果的准确性和可靠性保证，自身阳 性对照为最佳和首选，传统外部的阳性对照组织切片为单独一张切片，组织面积大且不宜与待检测组织在同一张切片上染色，多消耗试剂，有时也达不到实验条件的 一致性，而应用组织芯片技术在免疫组化及原位杂交中设立阳性对照有以下优点。 1)对一些抗体如p53、c-erbB-2、CD117、MART-A等，可针对性的选择阳性对照组织，摒弃阴性对照，同时节约了阳性对照组织，又可以节省试剂的成本。 2) 符合病理诊断的质控要求，提高病理报告的准确性和科学性，避免了因免疫组化结果不理想而导致出现病理诊断的疑难或病理诊断的误区。即使疑难病例病理切片会 诊，免疫组化或原位杂交切片因每一张切片上附有阳性染色对照组织，不会再次重复进行同样种类的免疫组化或原位杂交检测，节约医疗开支。 …………… …………………… 更多具体材料请参考： 芯片扫描仪及配件： http://proct.bio1000.com/100114/

求采纳

Ⅸ 免疫组化染色技术成功的关键是

正确答案:C
解析：抗体的质量是免疫组织化学技术成功的关键，同时也是必备试剂
。使用前应了解第一抗体和第二抗体的特异性和敏感性；通过预试验决定抗体的最佳稀释度；在已知阳性和阴性的标本上观察实验结果的符合情况
。

Ⅹ 免疫组化原理

免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。