pcr扩增技术以什么形式

❶ pcr扩增的原理

PCR扩增的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA扩增技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物PCR扩增仪延伸”三步反应的多次循环,使DNA片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中,靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中,且含量很低,对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因,杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级,再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用,如RT-PCR、竞争PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。

❷ 什么是PCR技术PCR的基本原理是什么

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

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PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

❸ 什么是pcr技术典型的pcr技术分为几个步骤

Pcr技术是指DNA的体外扩增技术，也叫DNA多聚酶链式反应，该技术分为变性、复性和子链延伸三个步骤，变性是高温下DNA解开双链，复性是DNA模板链与引物配时，子链延伸是按碱基互补配对原则合成子链。

❹ 什么是PCR技术

PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2ⁿ倍。

PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件：（①变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火；使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。

3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3’方向复制出互补DNA。

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【技术原理】

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

【工作原理】

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”。

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

【工作步骤】

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

❺ 目前的定量pcr方法基本上可归为哪几种

1、外参法+终产物分析。外参法是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
2、内参法+终产物分析。谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
3、外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
4、内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制。
5、外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。上述是定量pcr方法的五种类型。

❻ pcr扩增的原理和步骤

实验方法原理

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。

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PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

❼ 如何理解pcr扩增的原理和过程

PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

pcr扩增步骤

标准的PCR过程分为三步：

DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

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试验污染

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

污染原因

1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。

在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

4、实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。

但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

（1）标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

参考资料来源：网络-DNA的PCR扩增

参考资料来源：网络-聚合酶链式反应

❽ 什么叫PCR技术

PCR技术也就是基因扩增技术，它是通过基因扩增仪，在细胞外进行DNA复制，由1个DNA分子增加到2个，然后依次增加到4个，8个…，使分子数目呈几何级数增加，以在短时间内获得足够的DNA，供研究用的一种技术。

PCR技术的出现，使生物学的研究一大突破。在PCR技术问世之前，人们无法查出爱滋病病毒感染者，因为这种病毒在感染者体内的含量很少，且难于培养。在PCR技术问世之后，可将爱滋病病毒的核酸进行扩增从而查出受感染者，并可研究治疗方法。

PCR技术，还可对运动场上男扮女装的“女运动员”加以识别。过程如下：从自报是女运动员头上取1根带毛囊的头发，加蒸馏水煮沸，，使毛囊细胞破裂；把高速离心分离出的染色体放入其因扩增仪中进行基因扩增；大约2小时后，用一定的染料对扩增液染色；最后，把经染色的扩增液体涂在琼脂板上，用紫外线照射，如果出现橘红色光带，则说明染色体中含有睾丸决定基因（在Y染色体上），为男性，否则为女性。

目前，这项技术是性别鉴定中的最佳技术，准确性可达100%，也是迄今为止最文明的性别检测法之一，只要1根毛发即可辨男女。

1992年，在巴塞罗那奥运会上，组委会决定首先使用基因扩增法识别性别，但由于准备不足，只局限用于最可疑的少数运动员。1993年，在我国上海举行的首届东亚运动会上，全面使用了这一技术。在这届运动会前夕，有关科研人员进行了1037例“预试”，还进行了10例“双盲”（验方和递方都不知道头发是取自男还是女）试验，结果表明，准确率达100%！这种既文明又准确的性别鉴定法，解除了“性别舞弊”对运动会官员的困扰。

PCR技术已经在分子生物学中发挥了重要作用。可以预知，它在遗传病诊断、治疗，在动、植物育种，以及在司法破案等方面，将会发挥更大的作用。

❾ 什么是PCR扩增技术

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。

❿ pcr技术以指数方式扩增吗

A、PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，A错误；
B、PCR技术体外复制DNA以指数形式扩增，B正确；
C、PCR技术的原理是DNA复制，C正确；
D、PCR技术的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，便于根据这一序列合成引物，D正确．
故选：A．