① 乳酸菌的检测方法和培训资料！（越详细越好）
摘要：
〔目的〕探索用细菌学方法检测酵母浸出粉中维生素B族的存在。〔方法〕采用五种乳酸菌接种于含有被测的五种中外产的酵母粉培养基，用细菌学灵敏度、菌落计数和菌落直径测定的方法进行比较。〔结果〕经统计学处理，生长波度、菌落计数和菌落直径试验结果说明五种酵母粉之间有显着性差异，而灵敏度试验则未见显着性差异。〔结论〕酵母浸出粉中维生素B族生长因子的细菌学实验方法估计，可以参考生长浓度、菌落计数和菌落直径等综合性实
指标。
关键词：
乳酸菌；酵母浸出粉；维生素B族生长因子；生长浓度；菌数计数；菌落直径
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http://www.cnki.com.cn/Article/CJFD2002-RPGY200201006.htm
乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验
1 主题内容与适用范围
本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。
本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
3 术语
乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。
4 设备和材料
4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：46±1℃。
4.4 电炉：可调式。
4.5 吸管：容量为1，10和25mL。
4.6 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
4.7 平皿：直径为9cm。
4.8 试管：18×180mm。
4.9 显微镜。
5 培养基和试剂
5.1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。
5.2 改良MC培养基(Modified Chalmers培养基)。
5.3 0.1%美兰牛乳培养基。
5.4 6.5%氯化钠肉汤。
5.5 pH9.6葡萄糖肉汤。
5.6 40%胆汁肉汤。
5.7 淀粉水解培养基。
5.8 精氨酸水解培养基。
5.9 乳酸杆菌糖发酵管。
5.10 七叶苷培养基。
5.11 革兰氏染色液：按GB 4789.28规定执行。
5.12 3%过氧化氢溶液：按GB 4789.28规定执行。
5.13 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28规定执行。
5.14 明胶培养基：按GB 4789.28规定执行。
5.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB 4789.28规定执行。
5.16 生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。
6 乳酸菌菌落总数的测定
6.1 检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：
（略）
6.2 操作步骤
6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1∶10的均匀稀释液。
6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。
6.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
6.2.4 选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。
6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10－4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：
6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。
表1 乳酸菌在不同培养基上菌落特征
（表略）
7 乳酸菌的鉴定
对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。
7.1 菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24～48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
7.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。
表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
（表略）
表3 乳酸的链球菌的鉴别表
（表略）
参考资料：http://www.hopebiol.com/asphtml/refere85.htm
② 什么叫乳酸菌制剂它是如何生产的
所谓乳酸菌制剂，是指将乳酸菌培养后，再用适当的方法制成带活菌的粉剂、片剂或丸剂等。服用后它能起到调整肠胃功能和防治肠胃疾病的作用。生产乳酸菌制剂的常用菌种有链球菌、嗜酸杆菌和双歧乳杆菌等在肠内能够存活的菌种。乳酸菌制剂的生产工艺和生产方法如下：
（1）工艺流程鲜牛奶→离心分离→脱脂乳→杀菌→冷却→添加发酵剂→发酵→检验→干燥→成品（2）生产方法 将鲜牛奶离心分离除去脂肪得到脱脂乳。将脱脂乳煮沸15分钟后，冷却至40℃左右，然后添加生产发酵剂进行发酵。待酸度达240°T以后，停止发酵，并在45℃以内的条件下进行干燥粉碎，制成粉剂和片剂，如用冷冻干燥法进行干燥，则生产的产品质量，其活性更高。
③ 苹果酸乳酸发酵
苹果酸乳酸发酵
苹果酸乳酸发酵，很多不是很懂酒的人是不太清楚苹果酸乳是什么东西，其实它是会运用与在葡萄酒上的一种发酵物，它在葡萄酒中产生的作用是非常大的，以下是关于苹果酸乳酸发酵。
苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下将L-苹果酸脱羧基形成 L-乳酸的过程，是葡萄酒生产难以控制的二次发酵过程，主要由酒类酒球菌引起。
在葡萄酒的酿造过程中，苹果酸-乳酸发酵不仅可降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感，使之柔和、圆润，而且还提高了葡萄酒的感官质量和生物稳定性，所以，许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒都要进行苹果酸乳酸发酵。
北方地区气候寒冷，苹果酸度较高，酿造出的苹果酒口感较酸涩，需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。相反，南方地区苹果酸度较低，有些酿酒师并不提倡进行苹果酸乳酸发酵，所以更多的酿酒师考虑的是苹果酸乳酸发酵对葡萄酒、苹果酒风味的贡献。
MLF所需微生物
乳酸菌LAB在自然界广泛存在，可存在于葡萄的果实和叶梗的表面。LAB为原核微生物，革兰氏染色阳性细菌，其生长繁殖需要从生物氧化中获得能量，当某化合物氧化时便失去电子，为平衡代谢某化合物接受电子而被还原。在苹果酸乳酸转化中，苹果酸是电子供体，而乳酸是电子的受体。LAB也能用丙酮酸作为电子受体，并产生乳酸。
MLF对葡萄酒品质的影响
降酸作用
MLF将氢离子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03 g酒石酸酸度/L，pH增加0.3，这一点非常重要，因为如果葡萄酒pH低于3.5，LAB的代谢活性可以升高pH水平，从而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。
提高细菌稳定性
MLF可以提高葡萄酒中细菌的稳定性，MLF发生时由于营养物质的消耗或细菌素的产生其他微生物的生长受到抑制。MLF发生的时间也很重要，如果发生在葡萄酒装瓶之前，就可预防其在瓶中的生长。LAB在瓶中的生长或可引起葡萄酒浑浊、CO2产生，产生多糖导致酒体变黏，或pH提高促使其他腐败微生物的生长等。
风味的改善
葡萄酒经LAB发酵之后，不仅产生乳酸，也产生其他代谢产物，对葡萄酒的风味产生影响。 在有限通风条件下，酒类酒球菌倾向于产生乳酸和乙醇，欲产生更多乳酸则要求更多的通风。
然而，其他LAB在此条件下可能产生醋酸，醋酸本身有刺激性，所产生的醋酸的量非常重要，应避免超出感官检测的阈值。LAB产生的另一个重要的化合物是双乙酰，双乙酰有特征性的奶油风味。
双乙酰的形成取决于前体物质的出现，可由乙醛和乙酰CoA反应形成，或丙酮酸和乙醛反应产生五碳的乙酰乳酸，后者进而再形成四碳的'双乙酰分子和一分子CO2。LAB 发酵过程中可产生的 2，3-丁二醇来自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的风味，通常在检测阈值以下。
它的形成是一个还原的过程，即电子以乙偶茵和 2，3-丁二醇的形式固定。LAB 发酵过程中还产生乳酸乙酯、丙烯醛等，对葡萄酒的风味产生影响。在含氮丰富的果汁发酵时，葡萄酒中出现奶酪的风味。赖氨酸是酵母的重要营养，但过量添加会导致出现所谓的鼠臭味。一些植物乳杆菌和短乳杆菌代谢酒石酸为醋酸，产生所谓的败坏病，这些是葡萄酒酿造中不希望看到的。
诱发苹果酸-乳酸自然发酵需要采取以下措施：
1、PH值的调整：
当葡萄酒酸度比较高时，也就是在最需要进行苹果酸-乳酸发酵时，这一发酵就越难触发。
在这种条件下，轻度的化学降酸，将PH值提高到3.2，有利于苹果酸-乳酸发酵的触发。
为此，可通过在每升葡萄酒中加入500~1000mg碳酸钙或1000~1500mg碳酸氢钾达到这一目的。
2、温度的控制：
要保证苹果酸-乳酸发酵的触发和顺利进行，必须使葡萄酒的温度稳定在18~20℃。
因此，在红葡萄酒浸渍结束转罐时应尽量避免温度的突然下降，在气温较低的地区或季节还必须对葡萄酒进行升温处理。
最理想的升温方法是利用暖气对环境加热，但如果温度高于22℃，生成的挥发酸含量则较高，从而影响葡萄酒的质量。
3、二氧化硫的处理：
乳酸细菌对游离态二氧化硫较为敏感，结合态二氧化硫也会影响他们的活动，因此，对葡萄酒原料的二氧化硫处理酒成为控制苹果酸-乳酸发酵的必要条件，而且二氧化硫的用量应足以防治乳酸菌病害，但又不能成为在酒精发酵结束后苹果酸-乳酸发酵的限制因素。
为此，葡萄原料的二氧化硫处理最多不能超过100mg/l；
酒精发酵结束后应绝对避免葡萄酒的二氧化硫处理。
4、通风：
通风对乳酸细菌的生长常常是有利的。
因此正在酒精发酵结束后，可对葡萄酒进行适当的通气。
但是，在这一发酵过程中应尽量保证容器处于添满状态，以避免醋酸菌的活动。
利用正在进行苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒接种：
在葡萄酒酒精发酵结束以后，由于没有良好的发育条件和缺乏活泼的乳酸菌，有时苹果酸-乳酸发酵并不能立即进行。
这时可在含有多量苹果酸的葡萄酒中加入25~50%的正在进行或即将结束的苹果酸-乳酸发酵葡萄酒，或用这种葡萄酒换池时的酒脚或过滤的沉淀来接种。
在保持适当温度条件下，将酸度很高的葡萄酒与经过自然发酵酸度减弱等等葡萄酒相混合，这样就可从少量苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒出发，在数星期之内，使大量的葡萄酒降酸。
这一方法的缺点是：首先，必须有适合的葡萄酒；
其次，在接种后葡萄酒中的乳酸菌不一定会顺利繁殖；
若加大接种量，对于这种发放产生苹果酸-乳酸发酵显然是不必要的，但也许是不现实的。
人工诱发苹果酸-乳酸发酵——活性干乳酸菌的使用：
1、苹果酸-乳酸发酵的发酵剂：
景谷县一些即耐酒度、酸度，又首先转化苹果酸的优良乳酸菌株，经过大量繁殖之后作为发酵剂使用，可以使葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵安全可靠。
现在，国外市场已有葡萄酒明串球菌和乳杆菌制成活性乳酸菌发酵剂出售（有兴趣的伙伴八匠鼎松仁建议大家可以咨询查阅一番）。
目前发酵发酵剂的类型可分为液体培养发酵剂、冷冻干燥发酵剂、冷冻浓缩发酵剂和复合发酵剂4中。
他们的特点如下：
①、液体培养发酵剂：
其优点是活性高且适应力强，其缺点是保存时间短，在转移到新培养基之前，只能在冰箱中保存大约两周。
②、冷冻干燥发酵剂：
目前多数苹果酸-乳酸发酵剂大多采用此形式。
他们大量地接种和酒中以达到能触发苹果酸-乳酸发酵的菌群数，而且可以被贮藏在封闭物体或冰箱中，大约一年都不会失活。
有些冻干的发酵剂不用复水和再生酒可直接加到葡萄酒中。
其缺点是这些冻干的菌株不能再恶劣的环境汇总生长繁殖（例如在非常低的PH值、高酒精度、养分缺乏的葡萄酒中）；
③、冷冻浓缩发酵剂：
深度冷冻室最好的保藏发放，在-20℃~-80℃的温度下保藏。
细菌必须保持冷冻状态，一旦融化就必须复活或使用，而不能重新冷冻；
④、复活发酵剂：
有几种乳酸菌组成的发酵剂是有益的。
因为它能较好地适应葡萄酒中的营养条件并对破坏单菌株的噬菌体有抵抗力。
当使用复活菌株发酵剂时，要记住每个起始物培养基和葡萄酒都要选择特定的菌株。
这些发酵剂活活化后接到葡萄酒中，可以成功地触发苹果酸-乳酸发酵。
但是，用活性干乳酸有效地控制苹果酸-乳酸发酵，必须满足一下条件：
①、葡萄酒的总二氧化硫通常不能超过80mg/l；
②、活性干乳酸菌在接种前应在稀释一倍并含有5g/l酵母菌自溶物、PH值4.5的含糖为80g/l的葡萄汁中活化24~72小时，使活性乳酸菌群体数量达到107个/ml；
③、发酵温度必须控制在18~20℃的范围内，PH值3.2以上。
Hansens等人推出了无需活化即可直接接种于葡萄汁或正在进行酒精发酵的葡萄酒中的活性乳酸菌Viniflora LP。
改产品是由纯培养植物乳杆菌经过冷冻获得的活性干乳酸菌。
据研究报道，Viniflora LP在接种后可立即触发苹果酸的分解，并在3~7天内结束，且过程中不影响发酵和不产生挥发酸。
2、人工诱发苹果酸-乳酸发酵条件的控制：
①、葡萄收获季节到来之前，就实行苹果酸-乳酸发酵计划。
葡萄必须再没有腐烂现象的情况下采摘，以减少醋酸菌和野生酵母进入酿酒厂，这样可以保证二氧化硫添加量控制在50mg/l以下；
②、子啊压榨葡萄汁时加入少量或不加二氧化硫，无游离二氧化硫或微量，总二氧化硫控制在20~40mg/l，以消减一些潜在的有害细菌和酵母；
③、一般在酒精发酵快结束（残糖＜50g/l）或酒精发酵完成后即酒精浓度＜14%（体积分数）时接入乳酸菌为最好；
④、PH：3.2~3.5；温度：18~20℃；
⑤、分解L-苹果酸（每天下降0.1~0.2g/l）为好。
3、苹果酸-乳酸发酵结束的控制：
葡萄酒在经过苹果酸-乳酸发酵以后，其中的乳酸菌群体数量并不立即下降，子啊适宜的条件下，他们可以以平衡状态较长期地存在于葡萄酒中，在此期间可作用于残糖、柠檬酸、酒石酸、甘油等葡萄酒成分
引起多种病害和挥发酸含量的升高，因此，当通过纸层析检测到葡萄酒中无苹果酸时，已表明苹果酸-乳酸发酵结束，此时应立即分离转罐，以除去酒脚，同时需要进行20~50mg/l的二氧化硫处理，以充分抑制乳酸菌的活动，保证葡萄酒的生物稳定性。
苹果酸-乳酸酶的新技术：
1、苹果酸-乳酸酶的研究和应用：
葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的实质是乳酸菌中的众多酶类参与生化作用的结果。
根据这一机理，目前已研制出苹果酸-乳酸酶。
则为控制苹果酸-乳酸发酵开辟了新的途径。
研究人员正在努力提高这类酶对葡萄酒固定酶接种葡萄酒的方式促进苹果酸-乳酸发酵。
但现在面临的困难主要是在实践中很难获得大量的苹果酸-乳酸酶，而且在贮藏过程中，即使在-20℃的条件下，其活性也很快地下降，因此，这一方法仍处于实验阶段。
2、固定化乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵的应用：
由于乳酸菌的生长受到葡萄酒的ph、二氧化硫、酒精浓度的抑制，加之发现了静止乳酸菌细胞也可迅速降解苹果酸，不一定非在生长中的乳酸菌发生苹果酸的降解。
所以，近年来日本等过进行了固定化乳酸细胞进行苹果酸-乳酸发酵的研究。
其方法是采用海藻酸盐凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂、交叉菜聚糖加5%皂土等，把乳酸菌细胞（108~109个/ml）包埋于凝胶内，制成固定化乳酸菌细胞。
人喉将固定化乳酸菌装入柱中，串联或其他方法使用即可进行葡萄酒的苹果酸-乳酸连续发酵。
但由于反应器存在易污染杂菌、固定化剂和固定化细胞会脱落于葡萄酒中以及连续发酵细胞的活性会逐渐下降等缺点，尚需进一步完善，才能应用于工业化生产。
④ 请教：乳酸菌和酵母菌菌种保存
采用MRS培养基，液体和固体培养基分别做。固体斜面保存。液体试管保存。放在冰箱就可以。乳酸菌主要是培养基的营养成分要充足。 酵母菌就比较容易YPD就行。
⑤ 利用乳酸菌和牛奶生产酸奶这一过程利用的生物技术是什么
1.以酸奶源做酸奶，酸奶源和鲜牛奶的比例应该是1:10，只要你这次做完后在干燥的容器里留存一些新鲜的酸奶(按比例)，用保鲜膜封口放在冰箱内保鲜就可以了，但是为了保证酸奶源的活性，也不能放太长时间，3天之内就要用掉。
2.另外酸奶源不能无限制的多次循环使用，酸奶里益生菌的活性和繁殖性是有限的，多次循环使用后益生菌的再生的能力会不断下降，建议用自制酸奶作菌源最多用2-3次，或者也可以用酸奶作菌源后再用半包川秀乳酸菌(我用的也是这种)作酸奶，然后再用2-3次酸奶菌源，这样就能省些钱，也可以保证质量和口感。
3.要注意哦，益生菌要放在冰箱冷冻室保存，否则失去活性的菌类将失效而不能发酵作出酸奶。我每次都是放250ML的纯牛奶，然后放半包菌粉，你买的可能和我的是一样的500ML的机子。
延伸阅读：
酸奶为纯绿色食品，它是由牛奶经乳酸菌发酵制成的，除具有鲜牛奶的营养价值外，因内含乳酸菌并在发酵过程中产生乳酸及B族维生素(B2.B6.B12)等，可促进人体消化呼吸，提高人的免疫力，长期饮用即可保证钙质的需求，又可健肠胃，调节人体代谢，提高人的抗病能力，使人健康长寿，对儿童、老年人尤佳。因此已被越来越多的人所青睐。
⑥ 分离纯化乳酸菌的方法
（1）分离纯化乳酸菌时，首先要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释．泡菜滤液中乳酸菌的浓度高，直接分离很难分离到单个菌落，因此需要对泡菜滤液进行梯度稀释．
（2）在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用是中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸和利于乳酸菌的识别和分离；分离纯化时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌．
（3）若该同学采用稀释涂布平板法来检测泡菜滤液中乳酸菌的含量，先将lmL泡菜滤液稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0．lmL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37．据此可得出每毫升滤液中的活菌数为=（39+38+37）÷3÷0.1×100=3.8×10 4 个．
（4）若对筛选得到的乳酸菌进一步纯化，宜采用的纯化方法是平板划线法．乳酸菌在20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的甘油．
故答案为：
（1）泡菜滤液中乳酸菌的浓度高，直接分离很难分离到单个菌落（为了聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落）
（2）鉴别乳酸菌 具有透明圈
（3）3.8×10 4
（4）平板划线法 甘油
⑦ 乳酸菌发酵属于现代生物技术吗
属于！
多数为同型发酵，如链球菌属（Streptococcus），是与人类关系密切的重要菌群，有些菌是人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球菌（S．lactis）。少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）是制药工业上生产右旋糖酐（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工业的一种害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。
大多是工业上尤其是食品工业上的常用菌种。存在于乳制品，发酵植物食品如泡菜、酸菜，青贮饲料，及人的肠道、尤其是乳儿肠道中。乳酸菌发酵原理是在酶的催化作用下将葡萄糖转化为乳酸，同时放出能量提供给其自身生命活动。
工业生产乳酸常用高温发酵菌。例如德氏乳酸杆菌（L．delbrueckii），最适生长温度为45℃，此菌在乳酸制造（如：制造陈醋，酸奶等）和乳酸钙制造工业上广泛应用。
⑧ 水产乳酸菌活化方法
能用，反正也不会有什么负作用，无非是乳酸菌数量减少了，多少总有一些活的吧？当然效果肯定是差多了，菌类产品最好是当买当用，不宜长时间存放的，那怕没有过期效果也差了！对了如果你说的乳酸菌是给人喝的那就不能用了，我前面说的是水产养值业使用的菌类产品！
⑨ 水产用乳酸菌如何发酵的
常见的是用乳酸菌菌种、红糖和一定比例干净的水在桶里密封发酵，华畜水产乳酸菌直接化水后密封发酵，不需要培养基即红糖