pcr技术冷却后为什么要加热

① dna解链后冷却的目的

（1）PCR的原理是DNA双链复制．
（2）PCR技术通过高温加热使DNA解链，DNA的这种解链现象在一定的条件下是可逆的，即降低温度后能复性．
（3）DNA解链后冷却的目的是让引物与互补DNA链相结合，形成局部双链．
（4）当温度加热至70～75℃时，是热稳定DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸，通过磷酸二酯键连接到引物上．
（5）PCR技术中，目的基因以指数形式扩增．
故答案为：
（1）DNA双链复制
（2）高温加热    可逆的
（3）引物    互补DNA链
（4）热稳定DNA聚合     磷酸二酯
（5）指数

② 做荧光定量PCR时为什么有些需要热启动有些不用

热启动是为了提高特异性。需要热启动的试剂盒，Taq酶上加了一个封闭抗体，在不加热到设定的温度并维持一段时间前，抗体一直处于结合状态。这样，在没有到达优化温度时，taq没不发挥作用。就减少了非特异扩增的可能。“热启动”后，抗体失活，释放出Taq酶的活性中心。

③ pcr产物再加热有影响吗

pcr产物再加热没有影响。

PCR产物为DNA，DNA非常稳定，不易降解。所以72度延伸完就意味着PCR产物完成了扩增，随时都可以拿出来。但是PCR一般默认4度保存，因为温度越低越利于DNA的保存。

如果放在PCR仪里，就把PCR反应最后一步设为4度。此外，还可以放在4度冰箱。在阴凉的室内地面上先铺一层稻草，然后铺上约6厘米厚的沙，沙的湿度以手捏成团，松手即散为宜，再在沙上按一层板栗果实一层沙（每层3－6厘米厚）交替堆积。

步骤

首先，对待测基因进行PCR；然后电泳PCR结果；第三，对结果分析：若无特定的扩增片断出现，说明诊断的这个基因缺失了；若扩增片断的大小与正常基因不同，说明发生了病变。另外，对PCR扩增片段直接测序，可以诊断未知突变基因核苷酸的改变。纵观PCR法，可见关键是第一步骤即利用PCR技术扩增待测的目的基因，为进行基因序列的实验分析提供所需的足够材料。

④ PCR的原理是什么

PCR原理：

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

(4)pcr技术冷却后为什么要加热扩展阅读：

特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

⑤ 提取核酸时，加入蛋白酶后为什么要加热到65摄氏度

提取核酸时，加入蛋白酶后为什么要加热到65摄氏度
请注意：SDS对于脱氧核糖核酸酶以及核糖核酸酶均有抑制作用.
这里提供的是由Marmur于1961年建立,经Dale等人简化和发展,此方法略加修改后可用于其他细菌种类.主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞,酚－氯仿萃取蛋白,使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化,所提取的DNA无RNA和蛋白质污染,可用于限制性内切酶消化,分子克隆.
⑴材料
①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后,4摄氏度保存可长期使用)
②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理,市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色,需要重蒸二次,收集沸点160℃部分,小瓶分装,瓶内空腔充氮气,－20℃密封保存,以免氧化,用前从冰箱中取出,68℃蒸馏水饱和,加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g）,酚变为黄色.8—羟基喹啉是抗氧化剂,并能部分抑制核糖核酸酶,含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提,再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次,酚溶液的pH应大于7.6.此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月,纯化和制备酚溶液都要带手套,以免损伤皮肤.
③核糖核酸酶：无DNA酶污染,将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中,浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装后于－20℃保存.
④蛋白酶K
⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA
⑵方法
①取单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃振荡培养过夜.（使用试管）
②将上述菌液接种于200mlLB培养液中,37℃振荡培养过夜.（使用500ml或1000ml三角瓶）
③离心,收集沉淀（5000r/m,10分钟）
④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中,混匀.
⑤加入200mg SDS,室温下振荡过夜,使细菌细胞充分裂解,裂解液呈粘稠状
⑥加入等体积的酚/氯仿溶液,温和地混匀,细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面）,重复萃取三次
⑦加入2倍体积无水乙醇,此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集
⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中,加入核糖核酸酶（最终浓度50ug/ml）,37℃保温1小时
⑨加入蛋白酶K（50ug/ml）,继续保温1小时
⑩加入等体积苯酚萃取一次,在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇,－20℃静止过夜
25000g,4℃,离心15分钟,收集沉淀,用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干,溶于10mlTES缓冲液中,4℃保存备用.

⑥ PCR技术为什么一定要高温，为何不用普通DNA聚合酶如何进行循环的引物可以再生普通DNA聚合酶可以起始

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

⑦ 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化

第一个一般在94－95度左右,叫做变性,就是通过加热打开双链.
第二个温度点叫做退火,根据引物的TM算出,一般比TM低5度,有利于引物的结合.
第三个温度叫做延伸,一般采用72度.是引物结合后DNA聚合酶按照模板合成新的链.一分钟一千个碱基对.
如此循环.
现在很多PCR都采用2部法,由于采用了不同的DNA聚合酶（最佳温度60度）.这样退火和延伸采用一个温度.

⑧ 为什么在pcr反应过程中，使用三个不同的温度变化

第一个一般在94－95度左右，叫做变性，就是通过加热打开双链。
第二个温度点叫做退火，根据引物的tm算出，一般比tm低5度，有利于引物的结合。
第三个温度叫做延伸，一般采用72度。是引物结合后dna聚合酶按照模板合成新的链。一分钟一千个碱基对。
如此循环。
现在很多pcr都采用2部法，由于采用了不同的dna聚合酶（最佳温度60度）。这样退火和延伸采用一个温度。