程序如何判断图内含子区域

‘壹’ 怎样检查基因组注释结果的可靠性

基因组注释主要包括四个研究方向：重复序列的识别；非编码RNA的预测；基因结构预测和基因功能注释。我们将分别对这四个领域进行阐述。
1：重复序列的识别。

重复序列的研究背景和意义：重复序列可分为串联重复序列（Tendam repeat）和散在重复序列(Interpersed repeat)两大类。其中串联重复序列包括有微卫星序列，小卫星序列等等；散在重复序列又称转座子元件，包括以DNA-DNA方式转座的DNA转座子和反转录转座子(retrotransposon)。常见的反转录转座子类别有LTR,LINE和SINE等。
重复序列识别的发展现状：目前，识别重复序列和转座子的方法为序列比对和从头预测两类。序列比对方法一般采用Repeatmasker软件，识别与已知重复序列相似的序列，并对其进行分类。常用Repbase重复序列数据库。从头预测方法则是利用重复序列或转座子自身的序列或结构特征构建从头预测算法或软件对序列进行识别。从头预测方法的优点在于能够根据转座子元件自身的结构特征进行预测，不依赖于已有的转座子数据库，能够发现未知的转座子元件。常见的从头预测方法有Recon，Piler，Repeatscout,LTR-finder，ReAS等等。
重复序列识别的研究内容：获得组装好的基因组序列后，我们首先预测基因组中的重复序列和转座子元件。一方面，我们采用RepeatScout、LTR-finder、Tendem Repeat Finder、Repeatmoderler、Piler等从头预测软件预测重复序列。为了获得从头预测方法得到的重复序列的类别信息，我们把这些序列与Repbase数据库比对，将能够归类的重复序列进行分类。另一方面，我们利用Repeatmasker识别与已知重复序列相似的重复序列或蛋白质序列。通过构建Repbase数据库在DNA水平和蛋白质水平的重复序列，Repeatmasker能够分别识别在DNA水平和蛋白质水平重复的序列，提高了识别率。
重复序列识别的关键技术难点：
1）：第二代测序技术测基因组，有成本低、速度快等优点。但是由于目前产生的读长（reads）较短。由于基因组序列采用kmer算法进行组装，高度相似的重复序列可能会被压缩到一起，影响对后续的重复序列识别。
2）：某些高度重复的序列用现有的组装方法难以组装出来，成为未组装reads（unassembled reads）。有必要同时分析未组装reads以得到更为完整的重复序列分布图。之前，华大已开发了ReAS软件，专门用于识别未组装reads中的重复序列。但该软件目前只能处理传统测序技术(如sanger测序)生成的较长片段的reads，需要进一步改进方可用于分析第二代测序技术得到的reads。同时，未组装的短片段reads重复度更高，识别其重复区域具有较大难度。
重复序列识别的研究方向：
1）：整合现有的重复序列预测方法，对组装好的基因组序列进行分析。
2）：综合考虑并结合短序列组装策略，校正重复序列识别的结果。
3）：开发识别未组装reads重复序列的算法和流程并构建一致性序列。
2：非编码RNA序列的预测。

非编码RNA预测的研究背景和意义：非编码RNA，指的是不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA, rRNA等，这些RNA不被翻译成蛋白质，但是具有重要的生物学功能。miRNA结合其靶向基因的mRNA序列结合，将mRNA降解或抑制其翻译成蛋白质，具有沉默基因的功能。tRNA (转运RNA)携带氨基酸进入核糖体，使之在mRNA指导下合成蛋白质。rRNA(核糖体RNA)与蛋白质结合形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，提供mRNA翻译成蛋白质的场所。snRNA（小核RNA）主要参与RNA前体的加工过程，是RNA剪切体的主要成分。
非编码RNA预测的发展现状：由于ncRNA种类繁多，特征各异，缺少编码蛋白质的基因所具有的典型特征，现有的ncRNA预测软件一般专注于搜索单一种类的ncRNA，如tRNAScan-SE 搜索tRNA、snoScan 搜索带C/D盒的snoRNAs、SnoGps 搜索带H/ACA 盒的snoRNAs、mirScan 搜索microRNA等等。Sanger实验室开发了Infernal软件，建立了1600多个RNA家族，并对每个家族建立了一致性二级结构和协方差模型，形成了Rfam数据库。采用Rfam数据库中的每个RNA的协方差模型，结合Infernal软件可以预测出已有RNA家族的新成员。Rfam/Infernal方法应用广泛，可以预测各种RNA家族成员，但是特异性较差。我们建议：如果有更好的专门预测某一类非编码RNA的软件，那么采用该软件进行预测；否则，使用Rfam/Infernal流程。
非编码RNA预测的研究内容：利用Rfam家族的协方差模型，我们采用Rfam自带的Infernal软件预测miRNA和snRNA序列。由于rRNA的保守性很强，为此我们用序列比对已知的rRNA序列，识别基因组中的rRNA序列。tRNAscan-SE工具中综合了多个识别和分析程序，通过分析启动子元件的保守序列模式、tRNA二级结构的分析、转录控制元件分析和除去绝大多数假阳性的筛选过程，据称能识别99%的真tRNA基因。
非编码RNA预测中拟解决的关键技术难点：
识别非编码RNA的假基因：基因组中很多序列由非编码RNA基因复制而来，与非编码RNA基因序列相似，但不具有非编码RNA的功能。目前我们采用的非编码RNA序列的预测方法都是基于序列比对和结构预测，不能够很好的去除这类非编码RNA的假基因。针对这个问题，我们考虑结合RNA表达信息如RNA-seq数据进行筛选。
非编码RNA预测的研究方向：
1）：专门检测小片段RNA序列的方法现在已经得到广泛应用，利用小片段RNA序列数据进行非编码RNA的预测是我们的重要研究方向。
2）：开发miRNA靶向基因预测流程：miRNA通过调控其靶向基因的mRNA稳定性或翻译来控制生命活动的进程。预测miRNA靶向基因能够给我们研究miRNA功能带来提示。由于miRNA在动物和植物中对靶向基因的调控机制差别较大，我们建议对动物和植物分别建立靶向基因预测流程，提高预测准确度。
3：基因结构预测。

基因结构预测的研究背景和意义：通过基因结构预测，我们能够获得基因组详细的基因分布和结构信息，也将为功能注释和进化分析工作提供重要的原料。基因结构预测包括预测基因组中的基因位点、开放性阅读框架（ORF）、翻译起始位点和终止位点、内含子和外显子区域、启动子、可变剪切位点以及蛋白质编码序列等等。
基因结构预测的发展现状： 原核生物基因的各种信号位点（如启动子和终止子信号位点）特异性较强且容易识别，因此相应的基因预测方法已经基本成熟。Glimmer是应用最为广泛的原核生物基因结构预测软件，准确度高。而真核生物的基因预测工作的难度则大为增加。首先，真核生物中的启动子和终止子等信号位点更为复杂，难以识别。其次，真核生物中广泛存在可变剪切现象，使外显子和内含子的定位更为困难。因此，预测真核生物的基因结构需要运用更为复杂的算法，常用的有隐马尔科夫模型等。常用的软件有Genscan、SNAP、GeneMark、Twinscan等。
基因结构预测的研究内容：基因结构预测主要通过序列比对结合从头预测方法进行。序列比对方法采用blat和pasa等比对方法，将基因组序列与外部数据进行比对，以找到可能的基因位置信息。常用的数据包括物种自身或其近缘物种的蛋白质序列、EST序列、全长cDNA序列、unigene序列等等。这种方法对数据的依赖性很高，并且在选择数据的同时要充分考虑到物种之间的亲缘关系和进化距离。基因从头预测方法则是通过搜索基因组中的重要信号位点进行的。常用的软件有Genscan、SNAP、Augustus、Glimmer、GlimmerHMM等等。同时采用多种方法进行基因预测将产生众多结果，因此最后需要对结果进行整合以得到基因的一致性序列。常用软件有Glean，EVM等。
基因结构预测中拟解决的关键技术难点：
目前，真核生物的基因结构预测方法仍有较大改进空间，主要面临以下的技术难点。
1）：如何利用现有的数据和算法，更好地识别基因的可变性剪切位点。
2）：随着测序工作的进展，许多目前研究较少的物种也将提上测序日程。大多基因结构的从头预测算法需要预先训练预测参数。现有资源和数据稀缺的物种将很难获得预测参数。
3）：克服组装错误对基因结果预测的影响
4）：建立基因结构预测的评价系统。
可变性剪切位点的预测较为困难。如何结合RNA-seq数据进行可变剪切预测将是重要的工作方向和难点。
基因结构预测的研究方向：
1）：利用RNA-seq、EST等数据校正基因结构预测结果，识别可变剪切位点。
2）：对于研究较少的物种，建议利用近缘物种的同源基因数据以训练基因结构预测软件。
3）：利用同源基因组之间的共线性信息，辅助基因结构预测。
4：基因功能注释。

基因功能注释的研究背景和意义：获得基因结构信息后，我们希望能够进一步获得基因的功能信息。基因功能注释方向包括预测基因中的模序和结构域、蛋白质的功能和所在的生物学通路等。
基因功能注释的发展现状：全基因组测序将产生大量数据，而实验方法由于成本较高，不适用于全基因组测序的后续功能分析。为此，目前普遍采用比对方法对全基因组测序的基因功能进行注释。KEGG和Gene Ontology是目前使用最为广泛的蛋白质功能数据库，分别对蛋白质的生物学通路和功能进行注释。Interpro通过整合多个记录蛋白质特征的数据库，根据蛋白质序列或结构中的特征对蛋白质进行分类。
基因功能注释的研究内容：目前，我们利用四个常用的数据库进行基因功能注释。使用的数据库有Uniprot蛋白质序列数据库、KEGG生物学通路数据库、Interpro蛋白质家族数据库和Gene Ontology基因功能注释数据库。
1）：与Uniprot蛋白质序列数据库比对，获得序列的初步信息。
2）：与KEGG数据库比对，预测蛋白质可能具有的生物学通路信息。
3）：与Interpro数据库比对将获得蛋白质的保守性序列，模序和结构域等。
4）：预测蛋白质的功能。Interpro进一步建立了与Gene Ontology的交互系统：Interpro2GO。该系统记录了每个蛋白质家族与Gene Ontology中的功能节点的对应关系，我们通过此系统便能预测蛋白质执行的生物学功能。
基因功能注释中拟解决的关键技术难点：
目前我们的功能注释工作是建立在比对的基础上，这将会带来两个比较大的问题。首先，此方法严重依赖于外部数据，对某些研究较少的物种限制很大。其次，序列相似并不表示实际生物学功能相似，考虑引入序列比对之外的方法，进一步完善基因功能注释工作。
基因功能注释的研究方向：考虑引入序列比对之外的数据（如蛋白质互作网络、基因表达谱等），利用概率模型算法进行整合，完善基因功能注释工作。

‘贰’ 什么是生物中心法则

是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。

‘叁’ 详细介绍双序列比对、blast 以及多序列比对的区别,以及均适用于哪些场 景

序列比对是将两个或多个序列排列在一起，标明其相似之处。使用间隔表示未比对上，比对上的相同或相似的符号排列在同一列上。序列比对是生物信息学以及基因组学与进化的基础之一，其基本思想是：在生物学中普遍存在的序列决定结构、结构决定功能的规律，通过将核酸序列或者蛋白质序列的一级结构看成由基本字符构成的字符串，通过序列比对我们可以找到相似的序列并由此发现生物序列中的功能、结构和进化信息。
全局比对：全局比对是指将参与比对的两条序列里面的所有字符进行比对。全局比对在全局范围内对两条序列进行比对打分，找出最佳比对，主要被用来寻找关系密切的序列。其可以用来鉴别或证明新序列与已知序列家族的同源性，是进行分子进化分析的重要前提。其代表是Needleman-Wunsch算法。
局部比对：与全局比对不同，局部比对不必对两个完整的序列进行比对，而是在每个序列中使用某些局部区域片段进行比对。其产生的需求在于、人们发现有的蛋白序列虽然在序列整体上表现出较大的差异性，但是在某些局部区域能独立的发挥相同的功能，序列相当保守。这时候依靠全局比对明显不能得到这些局部相似序列的。其次，在真核生物的基因中，内含子片段表现出了极大变异性，外显子区域却较为保守，这时候全局比对表现出了其局限性，无法找出这些局部相似性序列。其代表是Smith-Waterman局部比对算法。
双重序列比对：双序列比对是指对两条序列M和N进行比对，找到其相似性关系，这种寻找生物序列相似性关系的过程被称为双序列比对。其算法可以主要分成基于全局比对的Needleman-Wunsch算法和基于局部比对的Smith-Waterman局部比对算法
多重序列比对：多序列比对是双序列比对推广，即把两个以上字符序列对齐，逐列比较其字符的异同，使得每一列字符尽可能一致，以发现其共同的结构特征的方法称为多序列比对。多序列比对算法可以分成渐进法和同步法。其可以发现不同的序列之间的相似部分，从而推断它们在结构和功能上的相似关系，主要用于分子进化关系，预测蛋白质的二级结构和三级结构、估计蛋白质折叠类型的总数，基因组序列分析等。
基因组比对：是多序列比对的一种特例，指对基因组范围内的序列信息进行比对的过程。通过对不同亲缘关系物种的基因组序列进行比较，能够鉴定出编码序列、非编码调控序列及给定物种独有的序列。而基因组范围之内的序列比对，可以了解不同物在核苷酸组成、同线性关系和基因顺序方面的异同，进而得到基因分析预测与定位、生物系统发生进化关系等方面的信息。
BLAST：BLAST[1]（Basic Local Alignment Search Tool）是在在1990年由Altschul等人提出的双序列局部比对算法，是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST是一种启发式算法，用于在大型数据库中寻找比对序列，是一种在局部比对基础上的近似比对算法，可以在保持较高精度的情况下大大减少程序运行的时间。
算法思想描述：
双重序列比对主要分成以Needleman-Wunsch算法为代表的全局比对和以Smith-Waterman局部比对算法为代表的局部比对，BLAST是局部比对的一种推广。多重比对算法可以主要分成动态规划算法、随机算法、迭代法和渐进比对算法。
（1）双重序列比对：
Needleman-Wunsch算法：该算法是基于动态规划思想的全局比对的基本算法，动态规划的比对算法的比对过程可以用一个以序列S为列，T为行的(m+1)×(n+1)的二维矩阵来表示，用
sigma表示置换矩阵。
在计算完矩阵后，从矩阵的右下角单元到左上单元回溯最佳路径（用箭头表示），根据最佳路径给出两序列的比对结果。其中，斜箭头表示2个残基匹配，水平箭头表示在序列S的相应位置插入一个空位，垂直方向的箭头表示在序列T的相应位置插入一个空位。

Smith-Waterman算法：该算法是一种用来寻找并比较具有局部相似性区域的动态规划算法，这种算法适用于亲缘关系较远、整体上不具有相似性而在一些较小的区域上存在局部相似性的两个序列。该算法的基本思想是：使用迭代方法计算出两个序列的相似分值，存在一个得分矩阵M中，然后根据这个得分矩阵，通过动态规划的方法回溯找到最优的比对序列。与全局比对相比，这种算法的改变是把矩阵单元值为负者一律取为0，这是因为分值为负的比对丧失了比对的生物学意义，因此把得分为负值的子序列丢弃。

BLAST: BLAST算法的基本思想是通过产生数量更少的但质量更好的增强点来提高比对的速度。算法的原理主要分为以下五步：（1）过滤：首先过滤掉低复杂度区域，即含有大量重复的序列；（2）Seeding：将Query序列中每k个字组合成一个表，即将一个序列拆分成多个连续的‘seed words’（通常蛋白质k=3，核酸k=11）；（3）比对：列出我们所关心的所有可能的字组，再配合置换矩阵给出高分值的字组并组织成快速搜索树结构或者哈希索引，因此此步骤可以快速搜索出大数据集中的所有匹配序列，找到每个seed words在参考序列中的位置；（4）延伸：当找到seed words的位置后，接下来需要将seed word延伸成长片段，延伸过程中，得分值也在变化，当得分值小于阈值时即停止延伸，最后得到的片段成为高分片段对，HSP（High-scoring segment pair）；（5）显着性分析，最后我们使用如下公式计算E值，E值衡量了在随机情况下，数据库存在的比当前匹配分数更好的比对的数目，因此可以用该值作为指标评价HSP比对序列的可信度。
其中，m是数据库长度，n是query的长度，S是HSP分数，其他两个参数是修正系数。

（2）多重序列比对

动态规划算法：其基本思想是将一个二维的动态规划矩阵扩展到三维或者多维，多序列比对的积分是n个序列中两两进行比对所得积分之和。矩阵的维度反映了参与比对的序列数。这种方法对计算资源要求比较高[6]。
随机算法：主要包括遗传算法和模拟退火算法，遗传算法是一类借鉴生物界进化规律演化来的全局意义上的自适应随机搜索方法。当用遗传算法进行生物序列分析时，每一代包含固定数量的个体，这些个体用他们的适应度来评价。变异则模拟了生物进化过程中的偶然残基突变现象。对产生的新一代群体进行重新评价、选择、交叉、变异，如此循环往复，使群体中最优个体的适应度不断提高，直到达到一个阈值，算法结束。模拟退火的基本思想是用一物质系统的退火过程来模拟优化问题的寻优方法，当物质系统达到最小能量状态时，优化问题的目标函数也相应地达到了全局最优解。这两种方法都是对构造好的目标函数进行最优解搜索，但实际比对效果并不好[6,7]。
迭代法：迭代法的代表是Muscle[8], Muscle是一个新的渐进比对和迭代比对的综合算法，主要由两部分构成，第一部分是迭代渐进比对：第一次渐进比对的目的是快速产生一个多序列比对而不强调准确率，以此为基础再对渐进比对进行改良。经过两次渐进比对，形成一个相对准确的多序列比对；第二部分是迭代比对：该过程类似于Prrp算法[9]，即通过不断的迭代，逐步优化最终比对结果。其主要特点包括：使用kmer counting进行快速的距离测量，使用一个新的图谱比对打分函数进行渐进比对，使用依赖于数的有限分隔进行细化。
渐进比对算法：该算法以Feng和Doolittle提出的最为经典[10]。渐进比对算法的基本思想是迭代地利用两序列动态规划比对算法,先由两个序列的比对开始，逐渐添加新序列，直到所有序列都加入为止。但是不同的添加顺序会产生不同的比对结果。确定合适的比对顺序是渐进比对算法的一个关键问题。通常，整个序列的比对应该从最相似的两个序列开始，由近至远逐步完成。作为全局多序列比对的渐进比对算法有个基本的前提假设:所有要比对的序列是同源的，即由共同的祖先序列经过一系列的突变积累，并经自然选择遗传下来的，分化越晚的序列之间相似程度就越高。因此，在渐进比对过程中，应该对近期的进化事件比远期的进化事件给予更大的关注。由于同源序列是进化相关的，因此可以按着序列的进化顺序，即沿着系统发育树(指导树)的分支，由近至远将序列或已比对序列按双序列比对算法逐步进行比对，重复这一过程直到所有序列都己添加到这个比对中为止[10]。其三个步骤为：（1）利用双序列比对方法对所有的序列进行两两比对，得到相似性分值；（2）利用相似性矩阵（或距离矩阵）产生辅助导向树；（3）根据导向树进行渐进比对。渐进比对算法是最常用、简单又有效的启发式多序列比对方法，它所需时间较短、所占内存较小，其算法很多，主要有CLUSTAL W, T-Coffee和DiAlign等，其中 CLUSTAL W应用最广泛。
应用：
类型+应用
双重序列对比：判断两个序列的同源性和一致性。（1）全局多序列比对可以鉴别或证明新序列与己有序列家族的同源性;帮助预测新蛋白质序列的二级和二级结构，是进行分子进化分析的重要前提。适合序列相似性较高，序列长度近似时的比对；（2）局部比对考虑序列部分区域的相似性。局部多序列比对可以用来刻画蛋白质家族和超家族。适合于未知两个序列相似程度的，可能存在一些片段极其相似而另一些片段相异的序列比对情况。
多重序列比对：多重比对经常用来研究序列间的进化关系，构建进化树；探究序列间的保守性。主要用于分子进化关系，预测蛋白质的二级结构和三级结构、估计蛋白质折叠类型的总数，基因组序列分析等。
基因组比对：通过对不同亲缘关系物种的基因组序列进行比较，能够鉴定出编码序列、非编码调控序列及给定物种独有的序列。而基因组范围之内的序列比对，可以了解不同物在核苷酸组成、同线性关系和基因顺序方面的异同，进而得到基因分析预测与定位、生物系统发生进化关系等方面的信息。
其中，BLAST作为最重要的比对工具，意义特殊，拿出来单独讨论。BLAST可以分成Basic BLAST和 Specialized BLAST, BLAST包括常规的nucleotide blast, Protein blast和Translating blast；Specialize blast可以对特殊生物或特殊研究领域的序列数据库进行检索。