反转录程序最后一步多少温度合适

Ⅰ 反转录PCR的操作

1. 总RNA的提取。
2. cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）：如今试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（2） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

Ⅱ 怎么确定反转录完的CDNA中还有没有GDNA污染

对于新手来说购买反转录试剂盒是比较理想的，买一个kit看看说明书操作就可以了。推荐两款kit TAKARA和HaiGene，这两款试剂盒都能对RNA样品中的gDNA有效去除，因此对RNA质量的要求不高。TAKARA的RR047A操作方便，反转录温度为37℃，对于大多数试验来讲是满足要求的。HaiGene的D0401操作要多一个步骤，但其反转录温度是55℃（耐高温的反转录酶），提高了反转录温度使得高GC含量、复杂模板、长mRNA的模板都能有效反转录，因此其反转录效率更高，更能够获得样本中基因的真实表达量。如果后续试验是RealTime PCR、ORF克隆、高GC含量、或者你的待研究基因结构复杂程度未知，还是选用耐高温的反转录酶更理想。对于反转录高手来说，直接购买反转录酶、再购买Rnase Inhibitor自己配制反转录体系就可以了。对于样本量大的课题组来讲，相对还是比较经济的。选择反转录酶时仅需要考虑是否需要耐高温的酶，来克服目的基因的复杂结构就可以了。PROMEGA、TAKARA、HaiGene、 TRANSGEN等品牌的反转录酶性价比还都是不错的。Life、NEB的也不错，银子足的也可考虑，不一一解释了。

Ⅲ rt-pcr逆转录的温度一般设置为多少

1.变性RNA的过程还没有加入反转录酶，请仔细阅读说明书！
2.反转录酶有很多种，针对高GC的RNA反转，可以加入适量DTT,DMSO,甜菜碱等降低退火温度。当然也可以选用耐高温的反转录酶。

Ⅳ 反转录酶的注意事项

反转录酶
在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：
1、RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。
2、引物的选择
OligodT
选择OligodT时，要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，所以对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（<500bp）的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，一般不推荐。

Ⅳ mRNA反转录形成cDNA的步骤

mRNA反转录形成cDNA的步骤如下：
将mRNA置于PCR仪中，经过95度变性、72度延伸、Tm温度退火，来回30~35个循环，最后4度就能得到反转录的cDNA。

Ⅵ rna转cdna预变性温度是多少

博凌科为的THERMOscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（第一链耐热反转录试剂盒）反转录温度耐受性比较强，效果不错
本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型 RNase H 活性缺失的 M-MuLV 反转录酶
THERMOscript Hˉ RTase 。 同时经过多点突变，提高了反转录温度耐受性，可以在 45-55℃进行反转录。野生型的 M-MuLV 包含的 RNase H 活性能够催化降解 DNA\\/RNA 杂合体中的 RNA，因此 在 cDNA 第一 条链的 合成 反应中 可能 会降 解 RNA\\/DNA 杂合 体中的 模板 RNA 。 本酶
M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失，与 M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性，
可用于较长的 cDNA 合成以及高比例的全长 cDNA 文库的构建等。同时更高的反转录温度大大的
提高了 GC 含量高，二级结构丰富的 RNA 模板的反转录效率。

注意事项::
1、 避免RNase污染。
2、为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
3、如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀，65℃变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

Ⅶ 逆转录原理

逆转录PCR （ RT-PCR ）的原理
逆转录PCR (RT-PCR )具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因定量分析、生物学检测等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。 本文主要讲述了逆转录PCR的原理、重要参数以及操作注意事项。
cDNA的合成是RT-PCR 的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。
逆转录PCR 重要参数
不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同;因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大，下述参数十分重要。
1.逆转录酶 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。
另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。
在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。
2.单价阳离子 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。
3.二价阳离子 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性;产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。
4.脱氧核苷三磷酸 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。
材料与方法

Ⅷ 人在冰棺里多少温度最合适

人在冰棺里－18℃最合适。

柜内温度可达－18℃。冰棺主要应用于尸体的冷藏，因此多被医院、殡仪馆、警察局、甚至是大众出租。冰棺在其特殊的行业中展现着其特有的作用。

最初我国并没有冰棺的制造技术，第一个冰棺的引入是在1925年。孙中山先生1925年逝世时，苏联政府于1925年3月30日来赠送过一个冰棺（也称玻璃盖钢棺），因孙先生已入殓，所以未使用。至今一直放在香山公园的孙中山纪念堂中。

相关如下：

冰棺材从外观看包括棺罩和箱体。棺罩是双层PC耐力板组成。内部饰以仿真鲜花，彩灯环绕。

箱体由外箱体和内箱体组成（外箱体主要有金属材料制作而成）。

内部制冷系统主要包括压缩机，冷凝器，蒸发器等部分。三个主要部分的共同工作达到制冷效果，从而保证机器内部温度低，保证尸体不腐。

Ⅸ RNA逆转录升温程序各阶段的作用

高温是解链和灭活反转录酶的 长久保存放-20

Ⅹ RNA是如何反转录成cDNA的过程和原理怎样请教

rna不纯化做反转录，cdna容易降解.
是的，得到的是全体mrna的cdna的库。然后通过pcr手段获得需要的目的片段。但是实际操作过程中，由于mrna的降解，因此一次实验不可能得到全部的cdna,因此要重复1~2次，才能保证全部mrna被反转录为cdna.
核糖核酸（缩写为rna，即ribonucleic
acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。rna由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。rna的碱基主要有4种，即a腺嘌呤、g鸟嘌呤、c胞嘧啶、u尿嘧啶，其中，u（尿嘧啶）取代了dna中的t。