⑴ 化学实验,用异丙醇和水回流的作用
异丙醇是常⽤作外⽤酒精主要成分的酒精猜信穗。在许多国家，外⽤酒精是消毒酒精，这种溶液通常包含坦态70%异丙醇或⼄醇，以及30%的蒸馏⽔。这种酒精的液体是变性的，方法是利用程序降温盒设定程序由室温降低至-80℃，利用穗卜异丙醇实现梯度降温，最后再放置到液氮槽中长期保存。
⑵ 细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol
复苏
细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。
步骤：
1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃
在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。
如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。
2、 解冻细胞。
做法有 2 种选择：
(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。
如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/超净工作台。
(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。
3、 接种细胞：
此时做法有 3 种选择：
(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。
(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。
细胞换液
细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。
步骤：
1、 准备工作：
预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。
如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。
如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。
不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。
细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。
对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。
预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。
吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。
一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。
用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。
强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。
细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。
当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。
加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。
EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。
TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。
最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。
吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。
在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。
将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。
通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。
对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。
细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。
对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行冻存。
预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。
准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。
按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。
将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。
如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。
如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：
优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。
DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。
对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。
自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。
在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。
冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。
有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当第一次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。
使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。
使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。
-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。
程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。
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⑶ 为什么 程序降温盒中异丙醇用5次就要更换
一般冻存盒中加入甘油的居多吧。丙二醇，异丙醇加入后，一方面防止由于溶液效应而使细胞脱水及蛋白质变性；另一方面在稍低于溶液冰点时人工强行诱导结冰，以免出现溶液过冷现象，防止结冰时释放潜热引起温度回升
⑷ 细胞培养之新手必看
细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。
一、准备工作
细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。
1.无菌室及无菌操作台
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%
ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar
flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
2.实验材料的准备
2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：
1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。
2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。
2.2培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
2.3 培养基的配制及分装
1）细胞培养基通常须添加10%血清，液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
2）粉末培养基(以1升为例)之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。高压灭菌后添加血清。
3）为避免培养基污染，可以在培养基中添加双抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若实验或细胞不允许，可将培养基少量分装。操作均在无菌条件下进行。
2.4 抗生素
1）ATCC细胞库之细胞培养基不加抗生素
2）培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
3）寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
4）若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。
5）去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
6）抗生素使用种类与浓度：
2.5血清
1）血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2）一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3）瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
3.培养箱及其他仪器的检查与调试
1）CO2钢瓶之CO2压力。
2）CO2培养箱之CO2浓度(5%)、温度(37度)、及更换水盘的无菌水(可添加消毒剂(Zephrin 1:750)每周更换。
3）无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
4. 其他试剂的配制及灭菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01M。高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，置于4度或常温保存。
4.2 无菌水：双蒸水高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，常温保存。
二、细胞传代培养
工作人员穿戴实验衣及手套进入无菌室，小心取用实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class
II)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。具体步骤：
粘附细胞：
1. 吸掉旧培养液。
2. 用PBS洗涤细胞一至二次。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。
4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
悬浮细胞：
1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。
2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
三、细胞冷冻保存
步骤：
1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3. 按细胞传代培养操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于含异丙醇的程序降温盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。
注意事项：
1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
2. 冷冻前检测细胞仍保有其特有性质。
3.冷冻保护剂DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4. 冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
四、细胞复苏
步骤：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3 将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
五、细胞计数与存活测试
1.存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 步骤：
2.1. 取50µl细胞悬浮液与50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
2.2. 取少许混合液(约15µl)自细胞计数版上方凹槽加入，于100倍倒立显微镜下观察，或于细胞计数仪中自动检测活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。
2.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml