基因扩增怎么设置程序

1. 简述PCR技术操作步骤

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。
主要的技术步骤是：
（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。
（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

2. 用同一种引物，同一种酶，对葡萄的DNA和cDNA进行pcr扩增，设置的pcr程序

详细内容可上试吧商城！！HotstartPCR：热启动PCR，是提高PCR特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生而阻止引物与基因组DNA上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。热启动PCR可通过三种方式实现：1)手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg离子或dNTP），当反应液升温到80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误差，可能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低2)将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；3)使用热启动DNA聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动DNA聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动DNA聚合酶的价格较高。TouchdownPCR：降落PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对PCR循环条件进行耗时的优化实验。降落PCR过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低10-15℃。在最初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。NestedPCR：巢式PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加DNA扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式PCR在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。Multiplex-PCR：多重PCR，指在一个PCR管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重PCR检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增6个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重PCR基础上发展的MultiplexLigation-dependentProbeAmplification(MLPA，多重连接探针扩增技术)使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重PCR耗时的优化步骤。LongPCR（LongdistancePCR，LongrangePCR）：长距离PCR，普通的Taq聚合酶一般只能扩增不超过3-5kb的片段，通过使用特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的DNA链（10-40kb以上）。长距离PCR时经常会在10-15个循环后，使每个循环的延伸时间都比上一循环的时间增加10秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。ClonyPCR：菌落PCR，通过PCR手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过PCR预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为PCR反应的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。RT-PCR（ReverseTranscriptionPCR）：逆转录PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：1.使用逆转录酶，通过逆转录反应“RT”合成与RNA互补的cDNA（complementaryDNA）2.使用PCR扩增特异性的cDNA。由于PCR的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。RT-PCR可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定RNA转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。RACE-PCR（rapidamplificationofcDNAends）：一种RT-PCR方法，当对DNA序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增cDNA的5'端（对应转录的起始位点）或3'端从而产生新的cDNA，重叠的RACE产物可结合起来产生全长的cDNA片段。DD-PCR(differentialdisplay)：差异显示技术，用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的RT-PCR产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带，只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。AsymmetricPCR：不对称PCR，可选择性的扩增出靶DNA的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称PCR的基础上发展出Linear-After-The-Exponential-PCR(LATE-PCR，线性指数PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。AssemblyPCR(也称作PolymeraseCyclingAssembly或PCA)：通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的DNA链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向DNA链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生最终的长链DNA分子。Methylation-specificPCR(MSP)：甲基化特异性的PCR，用于研究基因组CpG岛的甲基化模式。首先是用亚硫酸氢钠处理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量PCR，可以对甲基化程度进行定量。Ligation-mediatedPCR：连接介导PCR，首先使用小的寡核苷酸接头连接靶DNA片段，然后选择与接头结合的PCR引物来扩增未知的靶片段。这一技术主要用在DNA测序、染色体步移技术（genomewalking）和DNA指纹图谱等。AFLP（）：扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。AP-PCR(arbitraryprimed)/RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)：机扩增多态性DNA，使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因，形成基因组指纹图谱，用来分析物种的相关性。VariableNumberofTandemRepeats(VNTR)PCR：可变数目串联重复序列PCR，使引物定位在具有长度多态性的靶基因区，通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。Allele-specificPCR：等位基因特异性PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变定位在（或接近）引物的3'端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示不同的基因型。InterSequence-SpecificPCR(ISSR-PCR)：一种DNA指纹图谱技术，所选的引物定位在基因组的片段重复区（如Alu族），扩增后产生基于不同产物长度的唯一的指纹图谱。InversePCR：反向PCR，允许扩增已知序列侧翼的DNA区。首先将靶DNA用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。QuantitativePCR(Q-PCR)：定量PCR，用来测定样本中的靶DNA的量。最初的定量PCR主要是指CompetitivePCR（竞争定量PCR）。竞争定量PCR：在反应混合物中加入起始拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产物长度与靶序列产生的产物长度不同，在PCR过程中对照与靶基因竞争相同的引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推断初始靶基因的拷贝数，由于内部对照和靶基因在扩增中的效率不一定相同，所以定量结果会产生偏差。Real-TimePCR：实时PCR，由于通常的PCR在几十个循环后都会进入平台期，产物的量与初始模板量不在成正比，因此只能用来定性。而实时PCR通过使用荧光染料，例如SYBRGreen或荧光标记探针，例如TaqMan可用来检测随着扩增的进行，产物量的变化而进行定量。

3. 基因扩增程序设定是什么

基因扩增技术的具体方法和程序
试剂（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。操作程序过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进......阅读全文

基因扩增技术的具体方法和程序
试剂（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)

2022-09-06 17:05News WIKI 相关搜索
PCR基因扩增仪的原理和程序
  PCR技术即基因扩增技术。     PCR基因扩增仪扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片

2019-03-01 22:25News WIKI 相关搜索
100%有奖调查：聚合物的表征分析技术

什么是基因扩增？基因扩增的应用和技术优势
又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,

4. PCR扩增的步骤

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
模板DNA的变性
模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板DNA与引 物的退火(复性)
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸
DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

5. 两步法pcr程序设定

一步法,使用特殊引物,全程只设置一个温度即可完成扩增.这种特殊引物有专利.
二步法即循环扩增中设置2个步骤,这个方法主要扩增短片段,一个是95度变性,另一个是退火与扩增的温度,一般设置在55~60之间,当然也有例外.
三步法就是平常见到的方法,扩增循环有三步,变性,退火,延伸.

6. pcr扩增的原理和步骤

实验方法原理

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。

(6)基因扩增怎么设置程序扩展阅读

PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

7. 基因扩增的基因扩增-PCR技术

多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1．变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：使溶液温度降至50－60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。 1.PCR热循环仪 2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板
实验试剂
1．10×缓冲液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI(pH8.3，室温）、15mmol/LMgCl2
2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP
3.Tag酶5U/μL：
4.DNA模板1ng/μL：
5.引物1
6.引物2
7.引物溶液浓度2uM 1．在200ulEppendorf管内配制20ul反应体系
2．按下述程序进行扩增
94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause 1．引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；
2．PCR反应的各种成份不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；
3．根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；
4．注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。