程序性冻存盒使了多久后转移液氮

⑴ 液氮冻存组织后多久才能转移到

一般组织冻存都是先放到-70度，24小时后再放到液氮中，这样对组织损伤较小，没听说先放到液氮然后再放到-70，还有要看你做什么实验，有必要都放进去吗？你可以往液氮里放一部分，能保存半年，就是楼上说的放在自制的布袋里就行，-70再放一部分，可以保存三个月，做实验先用-70保存的，这样不是很好吗？本人拙见，不知对否。补充一点，少用冻存管，我们的经验都是用布袋，冻存管容易炸。布袋很好做，找块纱布缝一个也行。布袋用长线绳扎口，一端引到液氮罐外面。

⑵ 冻存盒放-80.后多久可以取出

冷冻4小时以上。
冻存管内的细胞已经处于凝固状态，如果此时冻存管内还是液体，很可能是DMSO或冰箱冷冻功能出现了问题。
如若遇到这种情况，不能因为时间到了，就把把液体状态的冻存管放置到液氮中，可以适当延长在零下20℃环境下的冷冻时间30到60分钟，直至冻存液凝固后再放到液氮中。

⑶ 2019-12-06

人正常肝细胞（ WRL68 ）的培养方法

细胞特性

2. 形态： 贴壁生长

3. 含量： >1x106

4 . 污染： 支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5. 规格： T25瓶或者1mL冻存管包装

WRL68是目前唯一能提供的人正常干细胞，之前很多人一直在问LO2,但是就目前情况来说，LO2在建系的时候就被海拉细胞污染了，所以基本无法提供，所以WRL68的重要性就凸显出来了。

运输和保存： 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。

细胞用途： 仅供科研使用。

细胞接收后的处理：

1.观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

2.贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

3. 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

4.备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1.准备MEM（推荐iCell-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2.培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3.冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配

二.细胞处理

1.复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2.细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

A 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

B 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

C 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀

D .将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注 ： 第一次传代推荐传代比例为 1:2 ，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3. 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例

A.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

B.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

C.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

注意事项：

1. 收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

⑷ 细胞培养(换液/传代/冻存/复苏)操作说明

所需试剂

细胞完全培养基：★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。

  （1）悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （2）贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （3）半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

2. 如需换液，参考以下步骤：

 （1）悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。

 （2）贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。

 （3）半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。

3. 之后，每2~3天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

  注意: 若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。

所需试剂

细胞完全培养基

贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（货号: GUTP-R001，以下简称胰酶）

1×PBS（货号: GUPB-R001，以下简称PBS）

1. 预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。

2. 细胞收集。

 （1）悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。

 （2）贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：

         ① 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。

         贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。

         半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。

        ② 加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。

        ③ 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

        ④ 吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

3. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

6. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

注意:  如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

7. 摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

8. 后续根据细胞生长密度和状态进行补液（悬浮细胞）/换液（贴壁/半贴壁细胞）、传   代或冻存等操作。

所需试剂

冻存液

★ 推荐使用海星HyCyte™一步冻存液（即用型、无血清、无需程序降温）

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻 存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

 注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请 将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

    注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

所需试剂

细胞完全培养基

★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

    注意: ① 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

             ② 管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次， 转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分 吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基， 摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。

    注意: 贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注 意事项见相应细胞说明书。

细胞处理原则

·  严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。

·  规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。

·  需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。

⑸ 干货分享 | ATAC-seq 和 Hi-C 样本制备

1. 冻存细胞样本

（1）取出培养的悬浮细胞，显微镜下观察细胞生长状态是否良好，是否有细菌污染，然后用PBS洗涤并离心弃上清，细胞沉淀进行冻存操作（贴壁细胞需要消化为悬浮细胞）；

（2）用冻存液重悬细胞沉淀，移至冻存管（提前配置细胞冻存液，要避免新配置的冻存液过热而损伤细胞）；

（3）冻存细胞解冻后，常规需要有5万个状态良好的细胞开展实验，因此建议将50万个细胞用于上述冻存操作；

（4）随后，将冻存管置于程序降温冻存盒，放在-80度进行梯度降温并暂时保存（严格按照程序降温操作，对细胞造成的损伤降到最低）；

（5）24 h后，将程序降温盒中的细胞样本转移至液氮中保存。

2. 动物组织样本

（1）取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪等杂质；

（2）将组织样本转移至新的离心管中，用预冷的PBS漂洗，直至将组织表面的残留血液冲洗干净；

（3）用无尘纸擦干水分，如果组织体积较大，应在冰上将组织切成小块，约50 mg/份，之后置于冻存管内；

（4）将冻存管迅速置于液氮中冷冻30 mins，然后转移至-80度中保存（要注意冻存管密封性和质量）。

3. 植物组织样本

（1）从植株取下新鲜幼嫩组织，取材后用清水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净，吸干表面水分；

（2）如果组织体积较大，应在冰上将组织切成小块或薄片，然后放入合适体积的冻存管或锡箔纸中，每份>200 mg；

（3）将冻存管或锡箔纸置于液氮中冷冻30 mins，之后保存于-80度。

1. 细胞样本

（1）确定细胞无污染，常规每个文库建议培养1x10^6用于甲醛固定（低细胞量可评估）；（2）新鲜细胞计数后重悬于完全培养基中，加入甲醛（终浓度2%)，室温固定10 mins；

（3）加入适量甘氨酸溶液，保证甲醛和甘氨酸充分混匀，培养基会由粉红色变为亮黄色，室温终止固定10 mins；

（4）离心弃上清，然后用PBS洗涤，再置于-80度保存。

2. 动物组织样本

（1）组织离体后，用预冷的PBS将组织表面残留洗净；

（2）用无尘纸擦干水分，在冰上将组织切成小块，约200 mg/份（肝脏、肾脏、脑、肌肉），之后置于冻存管内（低组织量可评估）；

（3）将冻存管放入液氮中冷冻30 mins，然后转至-80度保存。

3. 植物组织样本

（1）将幼嫩组织小心清洗干净，避免损伤；

（2）常规每个文库建议准备1 g幼嫩组织（低组织量可评估）；

（3）用锡箔纸包裹组织，置于液氮中冷冻30 mins，然后转至-80度保存。

⑹ 细胞培养|细胞冻存技术原理

1. 细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。

2. 在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。

1. 当温度低至-70℃时，细胞内的酶活性全部停止，代谢活动停止，故实现长期保存的目的。

2. 随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是0~-20℃的阶段，冰晶呈针状，及其引发细胞损伤。在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

3. 常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

1. 细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。

2. 对特别敏感的细胞在冻存时需测试适用的冻存液。例如神经元细胞冻存时需选择无血清冻存液，避免复苏后分化。

· 有限细胞系形态及代谢活动维持

· 珍贵细胞保种

· 细胞株标准品制备

· 脐带血干细胞、NK细胞冻存

1. 用来冻存的细胞一般选择在细胞对数生长期，汇合度约 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。

2. 对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。

1. 细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。

2. 梯度降温法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。

3. 细胞程序降温盒，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。

4. 在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。

1. 细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。

2. 细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。

3. 液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。

HyCyte™冻存液是一种即用型、无血清、无需程序降温的细胞“长期”冻存液，该产品配方使用已超过15年，原料均从日本进口，冻存品质与日本产品一致。

·  安全： 无血清，不含异种动物成份

·  广谱： 适合多种细胞类型

·  高效： 复苏后细胞保持高活性及快速增殖  能力，不影响细胞功能

·  方便： 即用型，无需额外配制，无需程序降温盒及稀释

细胞膜保护剂—可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。

渗透性保护剂—可迅速渗透至细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时可保护细胞器，减少其在低温下的损伤。

细胞沉降稳定剂—可平衡细胞沉降速度，防止细胞在冻存过程中聚集成团。

⑺ 细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol

复苏
细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。

步骤：
1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃
在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。
如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。

2、 解冻细胞。
做法有 2 种选择：
(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。
如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/超净工作台。
(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。

3、 接种细胞：
此时做法有 3 种选择：
(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。
(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。
4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。

细胞换液
细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。
步骤：
1、 准备工作：
预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。
细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。

如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。

不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。

细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。

一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。

强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。

细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。

当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。

加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。

EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。

吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。

在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。

将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。

通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。

对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。

细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行冻存。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。

准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。

按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。

将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。

如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。

如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：

优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。

DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。

对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。

自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。

在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。

冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。

有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当第一次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。

使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。

使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。

-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。

程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。

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⑻ ES培养基成分

不同的ES配方多少有些差异.基础培养基一般用DMEM或DF12.（以下为DMEM培养基为例）

1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;

2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。

ES细胞培养方法：

1. 化冻

   将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;

2. 灭活
   (1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);
   (2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME

   胞的培养;
   (2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;

3. 分装
   (1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;
   (2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1.取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死;

2.将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;

3. 把平皿转入超净台;

4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;

6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;

8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;

9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;

12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

1. 弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

2. 放入培养箱培养3小时(2-4小时);

3. 用0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;

4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

5. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。

ES细胞的复苏

1. 提前制备好相应数量的Feeder;

2. 准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;
   
   

4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;

5. 转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；

2.细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);

4. 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);

3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;

4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;

5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。

   
   

ES细胞的冻存

1. 常规方法将细胞消化成单细胞悬液;

2. 转入试管，1000转/分钟离心5分钟;

3. 配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);

4. 弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;

5. 放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。