1. 程序降温盒中途若是打开会怎么样
温度升高。破坏盒中细胞。程序降温盒使用的降温法，为一种特制冷冻容器，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。再冷冻的过程中不能开盒，开盒会使温度升高，破坏盒中培养的细胞。导致实验结果有误差甚至失败。
2. 细胞放在冻存管里然后放程序降温盒里，但是没有立刻放-80……
没事啊，正常步骤就应该4摄氏度2h，-20摄氏度2h，-80摄氏度2h，然后放液氮罐。
3. 聚乙烯程序降温盒原理
聚乙烯程序降温盒原理，见下面:
1.聚乙烯程序降温盒原理是将冷冻过程中温度变化通过智能温控仪表的RS485通讯协议接口传输给计算机的上位机软件。
2.上位机软件按照用户的编程，计算出当前的目标温度与实测温度的偏差值，用比例、微分、积分算法算出控制量。
4. 细胞培养之新手必看
细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。
一、准备工作
细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。
1.无菌室及无菌操作台
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%
ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar
flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
2.实验材料的准备
2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：
1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。
2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。
2.2培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
2.3 培养基的配制及分装
1）细胞培养基通常须添加10%血清，液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
2）粉末培养基(以1升为例)之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。高压灭菌后添加血清。
3）为避免培养基污染，可以在培养基中添加双抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若实验或细胞不允许，可将培养基少量分装。操作均在无菌条件下进行。
2.4 抗生素
1）ATCC细胞库之细胞培养基不加抗生素
2）培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
3）寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
4）若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。
5）去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
6）抗生素使用种类与浓度：
2.5血清
1）血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2）一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3）瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
3.培养箱及其他仪器的检查与调试
1）CO2钢瓶之CO2压力。
2）CO2培养箱之CO2浓度(5%)、温度(37度)、及更换水盘的无菌水(可添加消毒剂(Zephrin 1:750)每周更换。
3）无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
4. 其他试剂的配制及灭菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01M。高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，置于4度或常温保存。
4.2 无菌水：双蒸水高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，常温保存。
二、细胞传代培养
工作人员穿戴实验衣及手套进入无菌室，小心取用实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class
II)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。具体步骤：
粘附细胞：
1. 吸掉旧培养液。
2. 用PBS洗涤细胞一至二次。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。
4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
悬浮细胞：
1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。
2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
三、细胞冷冻保存
步骤：
1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3. 按细胞传代培养操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于含异丙醇的程序降温盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。
注意事项：
1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
2. 冷冻前检测细胞仍保有其特有性质。
3.冷冻保护剂DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4. 冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
四、细胞复苏
步骤：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3 将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
五、细胞计数与存活测试
1.存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 步骤：
2.1. 取50µl细胞悬浮液与50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
2.2. 取少许混合液(约15µl)自细胞计数版上方凹槽加入，于100倍倒立显微镜下观察，或于细胞计数仪中自动检测活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。
2.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml
5. 2019-12-06
人正常肝细胞（ WRL68 ）的培养方法
细胞特性
2. 形态： 贴壁生长
3. 含量： >1x106
4 . 污染： 支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
5. 规格： T25瓶或者1mL冻存管包装
WRL68是目前唯一能提供的人正常干细胞，之前很多人一直在问LO2,但是就目前情况来说，LO2在建系的时候就被海拉细胞污染了，所以基本无法提供，所以WRL68的重要性就凸显出来了。
运输和保存： 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。
细胞用途： 仅供科研使用。
细胞接收后的处理：
1.观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。
2.贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。
3. 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。
4.备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1.准备MEM（推荐iCell-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2.培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3.冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配
二.细胞处理
1.复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2.细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
A 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
B 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
C 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀
D .将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注 ： 第一次传代推荐传代比例为 1:2 ，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3. 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例
A.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
B.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
C.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
注意事项：
1. 收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。
2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
6. 程序降温盒放室温多久可以用
将程序降温盒放入-80℃冰箱,冷冻4小时以上以达到冻存效果即可使用。
7. 细胞冻存盒没有海绵可以用吗
细胞冻存盒没有海绵可以用。冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降1℃。目前也有商业化的快速冻存液。
8. 干货分享 | ATAC-seq 和 Hi-C 样本制备
1. 冻存细胞样本
（1）取出培养的悬浮细胞，显微镜下观察细胞生长状态是否良好，是否有细菌污染，然后用PBS洗涤并离心弃上清，细胞沉淀进行冻存操作（贴壁细胞需要消化为悬浮细胞）；
（2）用冻存液重悬细胞沉淀，移至冻存管（提前配置细胞冻存液，要避免新配置的冻存液过热而损伤细胞）；
（3）冻存细胞解冻后，常规需要有5万个状态良好的细胞开展实验，因此建议将50万个细胞用于上述冻存操作；
（4）随后，将冻存管置于程序降温冻存盒，放在-80度进行梯度降温并暂时保存（严格按照程序降温操作，对细胞造成的损伤降到最低）；
（5）24 h后，将程序降温盒中的细胞样本转移至液氮中保存。
2. 动物组织样本
（1）取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪等杂质；
（2）将组织样本转移至新的离心管中，用预冷的PBS漂洗，直至将组织表面的残留血液冲洗干净；
（3）用无尘纸擦干水分，如果组织体积较大，应在冰上将组织切成小块，约50 mg/份，之后置于冻存管内；
（4）将冻存管迅速置于液氮中冷冻30 mins，然后转移至-80度中保存（要注意冻存管密封性和质量）。
3. 植物组织样本
（1）从植株取下新鲜幼嫩组织，取材后用清水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净，吸干表面水分；
（2）如果组织体积较大，应在冰上将组织切成小块或薄片，然后放入合适体积的冻存管或锡箔纸中，每份>200 mg；
（3）将冻存管或锡箔纸置于液氮中冷冻30 mins，之后保存于-80度。
1. 细胞样本
（1）确定细胞无污染，常规每个文库建议培养1x10^6用于甲醛固定（低细胞量可评估）；（2）新鲜细胞计数后重悬于完全培养基中，加入甲醛（终浓度2%)，室温固定10 mins；
（3）加入适量甘氨酸溶液，保证甲醛和甘氨酸充分混匀，培养基会由粉红色变为亮黄色，室温终止固定10 mins；
（4）离心弃上清，然后用PBS洗涤，再置于-80度保存。
2. 动物组织样本
（1）组织离体后，用预冷的PBS将组织表面残留洗净；
（2）用无尘纸擦干水分，在冰上将组织切成小块，约200 mg/份（肝脏、肾脏、脑、肌肉），之后置于冻存管内（低组织量可评估）；
（3）将冻存管放入液氮中冷冻30 mins，然后转至-80度保存。
3. 植物组织样本
（1）将幼嫩组织小心清洗干净，避免损伤；
（2）常规每个文库建议准备1 g幼嫩组织（低组织量可评估）；
（3）用锡箔纸包裹组织，置于液氮中冷冻30 mins，然后转至-80度保存。
9. 细胞培养|细胞冻存技术原理
1. 细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。
2. 在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。
1. 当温度低至-70℃时，细胞内的酶活性全部停止，代谢活动停止，故实现长期保存的目的。
2. 随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是0~-20℃的阶段，冰晶呈针状，及其引发细胞损伤。在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
3. 常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。
1. 细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。
2. 对特别敏感的细胞在冻存时需测试适用的冻存液。例如神经元细胞冻存时需选择无血清冻存液，避免复苏后分化。
· 有限细胞系形态及代谢活动维持
· 珍贵细胞保种
· 细胞株标准品制备
· 脐带血干细胞、NK细胞冻存
1. 用来冻存的细胞一般选择在细胞对数生长期，汇合度约 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。
2. 对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。
1. 细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。
2. 梯度降温法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。
3. 细胞程序降温盒，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。
4. 在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。
1. 细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。
2. 细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。
3. 液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。
HyCyte™冻存液是一种即用型、无血清、无需程序降温的细胞“长期”冻存液，该产品配方使用已超过15年，原料均从日本进口，冻存品质与日本产品一致。
· 安全： 无血清，不含异种动物成份
· 广谱： 适合多种细胞类型
· 高效： 复苏后细胞保持高活性及快速增殖 能力，不影响细胞功能
· 方便： 即用型，无需额外配制，无需程序降温盒及稀释
细胞膜保护剂—可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。
渗透性保护剂—可迅速渗透至细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时可保护细胞器，减少其在低温下的损伤。
细胞沉降稳定剂—可平衡细胞沉降速度，防止细胞在冻存过程中聚集成团。
10. 程序降温盒能放-20吗
不能。
程序降温盒：液氮或低温储存（只要低于-135℃即可）。程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。