A. RNA-Seq数据分析——原始数据质量控制（QC）
RNA-Seq原始数据质量控制(QC)是非常重要的一个环节，由于各种原因，例如测序平台、实验操作等，原始测序数据可能存在不少问题，如低质量读段、接头序列、污染序列等。为了确保后续分析的准确性，需要先进行质量控制。
一、常用工具：
常用的质量控制工具有FastQC、MultiQC等，这些工具能提供测序数据的基本统计信息和质量报告。
二、QC主要步骤：
1.基本统计：
统计读段数量、平均长度等。
2.质量评分：
评估测序读段的质量分布，通常使用Phred质量分数。
3.接头和污染序列检测：
查找和去除可能的接头序列和其他非目标序列。
4.GC含量分布：
检查GC含量的分布，以判断潜在的偏见或污染。
5.重复序列分析：
评估重复读段的比例，高重复率可能意味着PCR偏见。
6.去除低质量读段：
基于设定的质量阈值去除低质量的读段。
7.后续步骤：
完成质量控制后，通常会进行比对、定量和差异表达分析等后续步骤。
B. 一文简介RNAseq生信分析流程
RNAseq简介
转录组测序分析（RNA-seq）通过提取并反转录特定mRNA，使用高通量测序统计相关小片段，以计算不同mRNA的表达量。此方法能精确识别可变剪切位点及编码序列单核苷酸多态性，为研究某一物种特定组织或器官的转录本序列提供了全面信息。RNA-seq在基础研究、临床诊断和药物研发中广泛应用。
RNAseq分析流程
RNA-seq流程一般包括实验设计、质量控制、比对、基因和转录定量、表达可视化、差异基因筛选、选择性剪接、功能分析和基因融合检测等模块。分析步骤多样，需要根据具体实验目的选择合适的方法。实验设计时需考虑目标RNA提取策略、文库类型、测序深度和实验重复次数。质量控制环节检查测序数据质量，包括测序深度、基因覆盖度均一性和测序饱和度。比对过程需使用适合的软件，根据研究目标选择比对到参考基因组或转录组。新转录本发现、基因和转录定量、差异基因表达分析、可变剪接分析和基因融合检测等步骤同样依赖于多种软件工具。分析流程结束生成统计报告。
六点了官网的RNAseq流程
六点了官网提供了一套通用RNAseq分析流程，涵盖数据过滤、比对、定量、差异分析、功能分析和可变剪接检测等环节。流程自动化生成统计报告，简化了分析过程。欢迎有需求的用户咨询。
RNAseq分析流程详解
实验设计：明确目标、选择提取策略和文库类型、确定测序深度和重复次数。
质量控制：检查原始测序数据质量，包括序列质量、接头存在、过度表达的kmer和重复序列分析。
比对：选择合适软件，直接比对到参考基因组或转录组上。
新转录本发现：使用特定工具识别。
基因和转录定量：整合比对结果，统计读数数量，转化为RPKM/FPKM/TPM。
差异基因表达分析：寻找组间显着表达变化的基因。
可变剪接分析：检测转录本结构的变异。
基因融合检测：识别基因序列融合。
六点了官网提供的流程：一站式分析服务，自动化报告生成。
C. RNA-seq原理详解
RNA-seq原理详解
1. 测序与定量: 先从测序得到的fastq文件出发，通过与参考序列进行比对与表达定量，生成原始的定量结果。结果显示在基因名与不同细胞系/处理名称的矩阵中，其中数字代表测序结果的定量值。
2. 数据标准化: DESeq2将原始reads进行建模，通过标准化因子（scale factor/size factor）来调整库深度差异。接下来，DESeq2估计基因的离散度，并缩小估计值，以此对reads count进行更精确的建模。标准化步骤包括：log转换、平均值计算、移除异常值、log转换与平均值差值计算、中位数计算与指数计算，最终得出样本的校正因子。
3. 差异分析: 计算log2foldchange与p值等，评估基因表达差异。results函数提取分析结果，包含基因在不同样本中的平均值、log2fold变化、标准误差、检验统计量、p值与调整p值。若某些基因在所有样本中表达量接近0，则无法计算lfcSE和pvalue，需将其移除，剩下17983个基因的差异表达结果。
4. 结果可视化: 基于原始测序文件fastq的表达定量，可绘制PCA图展示主成分分析，通过RNA-seq差异分析，绘制热图表示相对表达量（CPM），火山图则用于展示pvalue与foldchange。
实践指导与参考资源: 具体操作需亲自动手实践，过程中可能遇到bug。建议阅读相关文献与教程，包括但不限于jianshu.com、cnblogs.com、Question：如何计算基因表达的“fold changes”、Exact Negative Binomial Test with edgeR、Differential gene expression analysis、hbctraining.github.io/与Beginner's guide to using the DESeq2 package等。