Ⅰ 流式细胞术，你这磨人的小妖精
流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
一、小妖精的成仙之路
二、样本类型
流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。
三、工作原理
流式细胞仪主要由3部分组成：液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
四、流式细胞术的应用
五、操作过程中的注意点
1、上机前处理
小心荧光淬灭
操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。
注意染色顺序
在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。
选好染色方案
染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）
做好阴性对照及同型对照试验
细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。
同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。
选择合适的抗体
通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。
2、参数设定
数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。
电压
电压的调节需根据阴性对照管来调节。
阈值
可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。
目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。
补偿
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。
补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。
补偿的调节：根据单染对照管来调节。
六、数据分析
流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射（FSC，反应细胞的大小）和侧向角散射（SSC，反应细胞颗粒度）。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。
流式图的种类非常多，最常用的是流式直方图和流式散点图。
直方图
流式直方图只能显示一个通道的信息。
横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。
散点图
X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。
FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（左图）。
右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。
等高线和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。
密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。
三维图
Ⅱ 流式图解析
1. 流式细胞术：是基于细胞或颗粒光学散射特点和荧光信号差异对单个细胞或颗粒进行统计分析的一种检测方法。
2. 流式抗体：与普通抗体的不同，是偶联荧光素的抗体.
表达某一抗原的细胞与偶联荧光素的抗体特异性结合，经过流式细胞仪检测区时荧光素被激光激发，发射出的荧光信号被接收。
分析时反推回去：某种荧光信号→某种流式抗体→某种抗原→某种细胞。
3. 流式图：流式仪将接收到的光信号转化为电信号，经计算机转化为数字信号，绘制成图呈现。
一、流式图解析
1. 单参数直方图
2. 双参数散点图
3. 等高线图和密度图
流式数据分析的过程实际上就是在流式图上选门和设门的过程。
设门：是指用门选择某一或某些特性的细胞，是定性细胞亚群的重要方法。可以是单一门，可以使逻辑门。
门：可以是任意形状，可以封闭，可以开放（十字门）。门是人为设定的区域，有主观性，所以要设置对照使更客观。
设门需要考虑的因素——对照的设置
1). 必须有不染色的细胞作为空白对照
2). 抗原抗体的结合是否是特异性结合
a. 用同型对照判断是否存在非特异性结合
b. 用Fc block阻断细胞上的Fc受体非特异结合流式抗体
c. 用死活染料排除死细胞的干扰
3). 用阳性对照检验染色方案是否可行
4). 不同荧光素重叠光谱之间的补偿，单染管对照，FMO对照。
1. 单参数直方图
a.横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，可以是线性或对数坐标。
b.纵坐标一般是相对细胞数。
下图中，细胞样品染CD3 FITC抗体为例，通过横坐标的荧光强度，把此细胞样品分为两群，左边一群是CD3 negative，右边一群是CD3 positive，进而我们可以知道此细胞样品中CD3阳性细胞的比例是多少。
下图是单参数直方图的应用：
分群情况（下图）：
第一张图是：空白不染的细胞的检测图，
第二张图是：一个样本管，
第三张图是：有两个尖尖的峰顶，
第四张图是：很明显的两个峰，
其中，第三张和第四张画门正确，第二张图画门不正确，不能画门，不能用百分比，应该用MFI值表示阳性群，因为图二中群体比较均一。MFI中的M在大多数情况下是指mean值平均荧光强度。
mean,median,mode,Geom mean的区别：
mean是平均荧光强度，其缺点是：如果在当下视野里，细胞群体过大或过小，mean重复呈现性就会比较差。如果细胞群体都在视野里，可以用mean值。
median是荧光强度的中位数。100个细胞中50和51取个平均值。
mode是众数，是一组数据中出现次数最多的数量。峰顶对应的荧光强度即众数。
Geom mean是几何平均数，是指n个观察值连乘积的n次方根。
如果不是正态分布时，可以用Geom mean.
这四个值中，mean和Geom mean都可以代表整个细胞群的情况。mediun和mode只代表单一细胞的荧光强度。
选择用哪个值，是根据流式图的分布。在标准的高斯分布情况下，median=mean=mode，通常在流式中因为总会有异常值（超高或超低值）的存在，不是完美的高斯分布，建议使用medium，降低异常值对数据的影响。
2. 双参数散点图
散点图比直方图提供更多的信息。
等高线图比散点图更易分群。
横坐标和纵坐标都是光信号，十字门左下角是双阴性群，右下角和左上角是单阳群，右上角是双阳群。散点图上的每一个点可以代表某一个细胞的信息。
3. 等高线图和密度图（略）
4. 比较
二、补偿调节
1.荧光素补偿来源
a. adjacent detectors相邻通道的补偿：FITC和PE两通道互相逸漏。
b. resial base fluorescence偶联素相互之间的补偿
c. similar emission spectra（cross-laser）不同激光器激发，但是因为光斑的影响，也会逸漏滤光片相邻的两个通道。
2. FITC compensation
先上未染色的细胞作为空白对照，以调节各个荧光通道的电压；
然后单染管上样，比如上样FITC单染管，发现细胞群会飘到PE和percp-cy5.5通道里，会出现在双阳区域Q2。
调节补偿的原则：上谁的单染管就减去谁的通道里的光。
调完以后（下图），细胞群只落到了FITC单阳区。
调补长需要注意：
1. 同质性：不同细胞自发荧光强度不同
2. 阴性群：必须要有阴性群体
3. 阳性群：阳性群数量不一定要很多，但是阴阳群体一定要分得开。
未完待续
Ⅲ FlowJo流式数据分析基础——常见术语
FlowJo,由斯坦福大学Leonard Herzenberg实验室在90年代推出的流式数据分析软件，因其强大功能和易用性而备受科学家和实验室青睐，成为各类高影响力期刊中引用率极高的工具。当我们使用FlowJo进行数据分析时，一些术语至关重要。首先，了解参数图至关重要：
接着是门（Gate）的使用，有多种形式：
在数据统计方面，常用百分比和荧光强度(MFI)：
对于数据可视化，FlowJo支持峰图和点图的叠加，以及模拟分析，如细胞增殖、细胞周期和剂量效应分析。