① 微生物多样性研究中测序原始数据及其处理方式
1. 原始数据的解释及相关概念
原始数据的概念：
A.测序仪完成测序后生产的测序文件，经过单样品拆分后，获得的单样品测序文件。
B.或者 测序仪测序完成后，由测序仪直接拆分的单样品测序文件。
——我们常常称之为“Rawdata”
原始数据展示(illumina测序平台、Fastq格式文件):
Fastq格式文件：基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其质量信息的标准格式，其实质是一种数据存储格式，其序列以及质量都是使用一个ASCII字符标示，最初有Sanger公司开发，目的是将Fasta序列和质量数据放在一起，目前已经成为高通量测序结果的事实标准。
对于Fastq格式文件内容相关解释：
1）第一行以“@”开头，由文件识别标志和读段名（ID）组成；
2）第二行为碱基序列；
3）第三行以“+” 开头，也是由文件识别标志和读段名（ID）组成，其ID可以省略，但“+”不能省略；
4）第四行是第二行中的序列内容每个碱基所对应的测序质量值。
2. 数据质控
高通量测序下机的原始数据raw reads中存在一些低质量数据、接头以及barcode序列等，为消除其对后续分析准确性产生的影响，在数据下机以后对原始数据进行质控处理就成了至关重要的环节。
数据质控的概念：
将原始数据通过系列步骤（或同时进行）质量控制筛选的过程。
质控筛选后的数据，我们常常称之为“Cleandata”，也称之为“可以进行后续分析的序列”。
因各服务商提供的质控标准会略有不同，但大体包含（但不限于）如下几方面：
1）通过index提取序列，并作测序质量控制，质量达不到设置要求的去除，将序列与样本对应；
2）通过overlap完成拼接，去除index序列，overlap长度和错配要达到设置的要求，拼接不上的舍弃；
3）拼接完成且长度达不到设定要求的舍弃。
？问题：Cleandata（可用于分析的序列）跟最终参与分析的序列数量相等吗？
我们将在OTU聚类环节给出答案。
3. 原始数据的重要性
原始数据一切数据分析的根本。分析过程文件、结果文件可以丢失，原始数据在，分析结果可以重现；原始数据一旦丢失，分析结果则不可重现；
原始数据应及时索取或保存。
获取方式
1）服务商提供：硬盘、网盘、U盘、邮件等数据载体。
2）自留保存：硬盘、上传NCBI等数据载体。
文章发表时，均需要上传NCBI，并获得唯一项目号。
② 测序原理：一代二代三代测序原理详解
双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。其中Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。
其中Illumina市场规模占到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介绍它的PE（Pair End双端）测序原理：
名词：
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端闹行测序中间一些没有测到的区域
index(barcode)：一个lane通常要测多个样品，每个样品都加上特定的序列标签，用于区分不升橘同样品。
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会吵弯团种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A，加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列。
进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。
reads1 与 reads2 不发生重叠
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。
双端测序之Forward Strand ：
为什么Illumina测序会有长度限制呢？
Hiseq2000测序仪
测序仪搭配了两个flowcell，简称双流动槽。比较经典的Hiseq2500一次能产出700-800Gb数据（此处Gb为测序碱基数，不同于字节数的Gb）
数据量=单端reads长度 * 单端reads个数 * 2（PE)
测序深度=数据量大小 / 参考基因组大小
这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的。
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