‘壹’ 第二代基因测序产品研发主要面临哪些问题
1）测序文库构建（Library Construction）
首先准备基组（虽测序公司要求品量要达200ngGnome Analyzer系统所需品量低至100ng,能应用品限实验）DNA随机片段化几百碱基早烂棚或更短片段并两加特定接（Adaptor）转录组测序则文库构建要相麻烦些RNA片段化需反转cDNA加接或者历虚先RNA反转cDNA再片段化并加接片段（Insert size）于面数据析影响根据需要选择于陆则基组测序说通选择几种同insert size便组装（Assembly）候获更信息
2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification）
Solexa测序反应叫做flow cell玻璃管进行flow cell细8Lane每Lane内表面数固定单链接述步骤带接DNA 片段变性单链与测序通道接引物结合形桥状结构供续预扩增使用
‘贰’ 听说基因管家用第二代测序技术做基因检测准确率可以到99.5%，这是真的吗
是的，第二代基因测序技术可以解羡亮裂读30亿的碱基，数据量相当于60GB的“天书”（打印成兄闭册相当于100本牛津大辞典），对个体携带的20000+个基因进行分析解读，实现了真正意义上的个人基因组的全键销面检测，准确率达到了99.5%.
‘叁’ 科普讲堂 | 一代、二代、三代基因测序技术大对比
测序技术是基因组学的核心技术，是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。今天我来简单盘点一代、二代、三代测序技术的优劣势及应用情况。
一代测序是上世纪70年代由Sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，也称为Sanger测序。在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长共计5375个碱基。2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进行塌知了的Sanger法为其测序基础。
Sanger测序原理： 在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
一代测序虽然准确度十分高，且该技术在当下依然被广泛应用（比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到），但是通量太低，所以对于大片段或者全外显子等非常耗时，且很多情况下成本较高。
二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。刚面世时主要包括Roche公司的454技术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测序的通量，大大降低了测序成本和周期。
其中Illumina公司凭借超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10亿碱基）降到了到今天的40多块钱1G数据量，这个过程中基因组 De novo 测序、转录组测序、小RNA测序、LncRNA测序、circRNA测序、DNA甲基化测序、高密度遗传图谱、大规模GWAS关联分析等等实验手段得到了广泛的推广应用。近年来，NGS技术发展迅速，其应用已进展至临床检测，如无创产前、遗传性疾病，肿瘤（实体/血液）等。
Illumina 原理： 桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像。
主要步骤：
1、DNA文库制备——超声打断加接头；
2、Flowcell——吸附流动DNA片段；
3、档消桥式PCR扩增与变性——放大信号；
4、测序——测序碱基转化为光学信号衫吵。
二代测序技术虽然通量很高，成本低廉，但是读长实在太短，主流的Illumina测序仪，常规模式只能测PE150的长度，靠着软件算法上的进步才得以可用。由此三代测序走上了历史舞台。
三代测序主要有两种技术：PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术，这两种技术的测序读长都可以达到几十kb的级别，远远高于二代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。实现了对每一条DNA分子的单独测序。单分子测序可以更准确地检测串联重复扩增等。这对于无参物种的分子生物学研究大有帮助，长读长对于基因组拼接、全长基因序列的获取提供了巨大的便利。
Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：
1、聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部；
2、4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部；
3、荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光；
4、荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基；
5、统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列；
6、酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落；
7、聚合反应持续进行，测序同时持续进行。
但是三代仍然不是完美的技术，其测序错误率相对于一代和二代还是高了很多，另外通量还是远低于二代测序，导致成本也是数倍于二代测序。
胡润 | 文案
‘肆’ 测序原理：一代二代三代测序原理详解
双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。其中Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。
其中Illumina市场规模占到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介绍它的PE（Pair End双端）测序原理：
名词：
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端闹行测序中间一些没有测到的区域
index(barcode)：一个lane通常要测多个样品，每个样品都加上特定的序列标签，用于区分不升橘同样品。
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会吵弯团种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A，加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列。
进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。
reads1 与 reads2 不发生重叠
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。
双端测序之Forward Strand ：
为什么Illumina测序会有长度限制呢？
Hiseq2000测序仪
测序仪搭配了两个flowcell，简称双流动槽。比较经典的Hiseq2500一次能产出700-800Gb数据（此处Gb为测序碱基数，不同于字节数的Gb）
数据量=单端reads长度 * 单端reads个数 * 2（PE)
测序深度=数据量大小 / 参考基因组大小
这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的。
1. https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2
2. https://zhuanlan.hu.com/p/20702684
3. https://mp.weixin.qq.com/s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg
4. https://mp.weixin.qq.com/s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A
‘伍’ 二代测序为什么有的用G有的用reads代表测序深度
二代戚厅测序中G就是Gb跟硬盘的Gb一样，因为数据量非常大，所以一般都用多少G来生命测序得到的碱基数据。reads是指读出的短序列、短片段。测序深度一般用数字加乘号来表示比如100X这样。表示测序实际得到的有效碱基数据比模板实际碱基数据。
二代测序技术可以帮助发现新的治疗靶点，可以是新基因上的新靶点，也可以是已知基因上的耐药靶点；还可以帮助患者选择更好的治疗方式，这在靶向治疗和免疫治疗时代显得尤为重要；最缓山后它还可以帮助预测癌症的复发，以及筛查早期癌症。
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‘陆’ 病原学宏基因检测二代测序费用多少
看你需要的数据量，6-10G数据量/样，大概300-500吧，不同的服务公司价格有差别
‘柒’ 为什么二代测序又叫深度测序
在二代测序中,为了有效覆盖全基因组,获得的数据量一般是被测基因组的颂桐几十倍,然后再拼接.
也就是说,理论上,每个位点都要被覆盖几十次甚至上唤樱耐百次和春,这个次数就叫测序深度
所以,二代测序也成为深度测序
‘捌’ 第二代测序技术能测基因组全长吗
第二代测序技术能测基因组全长
测序文库的构建（Library Construction）
首先准备基因组（虽然测序公司要求样品数郑迅量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品薯此量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便丛吵在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。
‘玖’ 基因组测序的测序深度一般是多少
基因组测序的测序深度一般是10X。
测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。
基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，个体的行为特征及行为合理，如癌症或白血病，运动天赋，酒量等。