做流式活细胞占比多少数据可靠

❶ 流式细胞分析术的工作原理

流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。国外又把流式细胞计称作荧光激活细胞分选器(Flu-orescence Activated CellSorter,FACS)。美国Becton—Dickinson 公司生产的流式细胞计系列均冠以FACS字头。目前中国国内使用的仪器多为美国、西欧及日本等国的产品，国内有些单位也已研制成功，但尚无定型产品面市。
流式细胞计的基本结构流式细胞计组成
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
⑴流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
⑵激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
⑶光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
⑷计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
参数测量、样品分选及数据处理
⑴参数测量原理：流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射(FSC)；②侧向散射(SSC)，又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
⑵样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。
稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V,或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。
(50)数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。
①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图(histogram)、二维点图(dot plot)、二维等高图(contour ）、假三维图(pseudo 3D)和列表模式(list mode)等。
直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度，用“道数”(Channel No .）来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。
二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标植的细胞存在（图10-3)。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。
二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。
假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ，这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。
列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用List Mode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。
上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。
②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。
逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。
逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。
因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。
流式细胞计的技术参数 为了表征仪器性能
往往根据使用目的和要求而提出几个技术参数或指标来定量说明。对于流式细胞计常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。
⑴荧光分辨率：强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰，荧光分辨率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数(C.V值）来表示。C.V的定义式为：
C.V=σ/μ
式中，σ为标准偏差，μ是平均值。
在实际应用中，我们使用挖关系式σ=0.423FWHM；其中FWHM为峰在峰高一半处的峰宽值。目前仪器的荧光分辨率均优于2.0%。
⑵荧光灵敏度：反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出的FITC(fluorescein isothiocyanate 异硫氰基荧光素）的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。
⑶分析速度/分选速度：仪器每秒种可分析/分选的数目。一般分析速度为5000～10000；分选速度掌握在1000以下。
⑷样品浓度：主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在1010细胞/ml的数量级。
其它技术参数尚多，不再一一介绍。
流式细胞计的调试和使用
古语说：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地应用流式细胞分析和分选技术，必需先对仪器进行调试，使其处于良好的工作状态，并能正确使用仪器。下面简要介绍细胞计的调试项目及要点、使用的程序等等。
⑴调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。
激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。
液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节 气体压力大小以获得稳定的液流速度。
测量区光路调节 ：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。
流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。Flow Cytometry Stands公司可提供荧光强度药盒，在免疫实验中可用来作为定量荧光标准来测定每个细胞所标记的抗原位点数目。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：鸡血=1：4)，经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h,最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。
⑵仪器的操作和使用：
①打开电源，对系统进行预热；
②打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；
④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上,0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；
⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；
⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；
⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；
⑧将所需结果打印出来。
在操作和使用中一定要注意如下事项：
1)光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；
2)光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；
3)液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；
4)注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；
5)特别强度每次测量都需要对照组。

❷ MTT细胞存活率与流式检测的活细胞率是对应的吗

要看你流式用的是哪种方法了。

如果单用PI染色，阳性的就是死细胞。细胞膜受损。
如果用Invitrogen的Live/Dead方法，死细胞和活细胞都能分别染色。活细胞内ATP充分。酶还有活性。可以产生荧光物质。死细胞的细胞膜损坏，导致DNA被染色。

理论上比例应该接近，但是原理不是完全相同。所以结果会有一些差别。

❸ 流式细胞术的作用原理

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

❹ 流式细胞术：原理、操作及应用的目录

序
前言
1 概述
1.1 流式细胞术基本概念
1.2 分析型流式细胞仪介绍
1.3 分选型流式细胞仪介绍
参考文献
2 流式细胞仪的原理
2.1 液流系统
2.2 光路系统
2.3 检测分析系统
2.4 分选系统
参考文献
3 流式图
3.1 流式通道
3.2 流式直方图
3.3 流式散点图
3.4 流式等高线图
参考文献
4 流式细胞术的基本操作与技巧
4.1 样品制备
4.1.1 独立细胞样品制备
4.1.2 免疫器官样品制备
4.1.3 实体脏器样品制备
4.2 荧光素偶联抗体及其标记方法
4.2.1 荧光素
4.2.2 荧光素偶联抗体
4.2.3 样品封闭
4.2.4 荧光素偶联抗体标记
4.3 光电倍增管电压设定
4.4 对照的设置
4.4.1 阴性对照的设置
4.4.2 FM.对照
4.4.3 阳性对照的设置
4.5 补偿调节
4.5.1 补偿调节的原理
4.5.2 调节补偿的具体方法
4.5.3 三色和四色分析补偿调节方法
4.5.4 影响补偿大小的因素
4.6 阈值设定
4.7 流式分析中的死细胞问题
4.7.1 减少样品中死细胞比例的方法
4.7.2 流式分析时区分死细胞和活细胞的方法
4.8 流式分选模式选择
4.8.1 纯化模式
4.8.2 富集模式
4.8.3 单细胞模式
4.9 上样速度控制
4.9.1 流式分析速度控制
4.9.2 流式分选速度控制
4.10 分选设门基本原则
4.11 流式分选基本步骤
参考文献
5 流式分析术的应用
5.1 细胞群比例测定
5.2 表型测定
5.3 检测细胞因子
5.3.1 胞内染色法检测细胞因子
5.3.2 胞内染色法与ELISA法比较
5.3.3 CBA法测定细胞因子
5.3.4 CBA法与ELISA法比较
5.4 检测细胞增殖
5.4.1 相对计数法
5.4.2 示踪染料标记法
5.4.3 Br标记法
5.4.4 其他方法
5.5 检测细胞凋亡
5.5.1 annexinV/PI双染色法
5.5.2 SYTO/PI双染色法
5.5.3 细胞：DNA含量分析法检测细胞凋亡
5.5.4 线粒体损伤检测法
5.5.5 活化的caspase-3检测法
5.5.6 荧光素偶联的caspase抑制剂(FLICA)标记法
5.5.7 甲酰胺诱导ssDNA单抗检测法
5.5.8 TUNEL法
5.6 检测细胞周期
5.6.1 非特异性核酸荧光染料标记法
5.6.2 特异性细胞周期调节蛋白检测法
5.7 检测细胞杀伤能力
5.8 检测细胞吞噬功能
5.9 检测胞内活化的激酶
5.10 检测基因表达
5.10.1 GFP报道基因系统
5.10.2 JocZ报道基因系统
5.10.3 内酰胺酶报道基因系统
5.11 微生物学中的应用
5.11.1 荧光素偶联抗体直接检测法
5.11.2 抗体结合人工荧光微球直接检测法
5.11.3 微生物活性流式检测
5.11.4 人工微球荧光免疫试验检测抗体
5.11.5 荧光原位杂交流式检测法
5.11.6 PCR免疫微珠法
5.11.7 原位PCR杂交流式检测法
5.12 检测钙相关分子
5.12.1 检测细胞内游离的钙离子水平
5.12.2 检测钙蛋白酶活性
5.12.3 检测细胞膜钙泵活性
5.13 表观遗传学中的应用
5.13.1 ChIP一0n-beads法
5.13.2 检测细胞水平组蛋白修饰情况
……
6 流式分选术的应用
参考文献

❺ 流式细胞术中的“鬼”故事（引子）

万圣节快到了，让我们聊点灵异的话题。

大家在做流式细胞术的时候会遇到很多和死活细胞有关的故事。

例如下面的一些小故事，不知道大家有没有遇到过？

我们一起来看看吧。

故事一，有时我们在流式细胞仪上样的时候，有的样本细胞已经死了，但是有的样本类型细胞还活着。

故事二，明明已经都染了很多荧光染料了，根据SOP还要再对死细胞染色，为什么呢？只是导师钱多用来花式炫富的么……

故事三，染个死细胞，共聚焦里面DAPI细胞核都染的好好的，怎么在流式细胞仪上就不灵了呢？

故事四，为啥我的生物样本，用PI染色，活细胞的PI的MFI（平均荧光强度）比死细胞还高？

故事五，我做细胞内染色，细胞即将要固定破膜，那么我区分死细胞还能使用PI或者7AAD么？

故事六，为啥我去约分选，分选老师知道我的样本内加入了PI用于去死细胞之后，他有点不想让我约仪器？

故事七，显微镜下可以观察到死细胞发生了细胞体积的膨胀，明明比活细胞的直径大，为啥死细胞的FSC(前向散射信号)要比活细胞小，FSC不是反应细胞的相对大小么？我这是除了在显微镜下看到了死细胞，难道还看到鬼了么？

故事八，为啥做T细胞分化实验，隔壁实验室的猥琐师兄每次做的结果都那么好，而用他的诱导条件，我们所的其它相关实验室都重复不出来，难道他有霍格沃兹y的学位证书？

故事九，导师让我帮实验室订购在流式细胞仪上用于区分死活细胞的荧光染料，哎呀，我的这个选择困难症又犯了，我要休假，不对，我觉得我需要抢救一下……

不知道大家有没有成为上面故事中的主角，或者大家本身还有其它与死细胞更好玩的小故事，欢迎大家在下面留言分享。

❻ 流式细胞仪的原理是什么

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

样品分选原理流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

（50）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。

直方图是一维数据用作最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，坐标可以是线性标度或对数标度，用“道数”来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。坐标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。坐标和坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

二维点图二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。

假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。

图10-6从二维图设窗调出直方图示意上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。

②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。

因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。

❼ 流式细胞术的应用范围

随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用 阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的记数。
自70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。
在肿瘤学中的应用
这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。
(1)发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断：人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。
(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用：FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。
FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。
此外FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中[3，4]。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。
在临床中的作用
FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果T4/T8比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于艾滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨[5]。
目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。
在血液病诊断和治疗中的应用
FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。
(1)白血病的诊断和治疗：FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34，髓系表达CD13、CD14，B细胞系表达CD10、CD19、CD20等，T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。
同其它肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。
目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物，成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。
(2)其它种类血液病的诊断和治疗监测：阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度[8]。
(3)网织红细胞的测定及临床应用：网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义[10]。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。
在血栓与出血性疾病中的应用
(1)血小板功能的测定：正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段[11]。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定，只需微量标本，适合于儿童及血小板减少性疾病的患者[12]。 血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显着改变，FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。
此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的测定：免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板，FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。
质量控制
一、流式细胞仪的校准
流式细胞仪的校准包括流路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性。对仪器的校准主要是利用标准微球进行监测。聚苯乙烯可以被做成各种大小的微球，也可被荧光标记或者拥有定量免疫球蛋白的结合位点。这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式质控中的一个常用的标准品。
二、实验操作过程的质控
1、样本的质量控制
用于流式分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。首先，观测样本外观：有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。
第二，单细胞悬液的获取：外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液；活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验要求适用不同的方法。对于需要进行膜抗原标记的，不仅是要获得足够的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，机械法较适用。只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）较适用。
第三，抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝；对于血小板分析的实验，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。
第四，样本的保存：理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温（16-25）；对于只作胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。但此“固定－染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。
第五，去除红细胞的方法：红细胞裂解法，操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需确认：（1）抗原性不被溶血过程改变；（2）溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；（3）所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。密度梯度离心法，靶细胞回收较好并可能得到富集，同时去除红细胞、碎片等，但费时，某些重要细胞群体可能被选择性丢失。
第六，细胞与抗体的比例：厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X105 ~1x106范围内。有些标本没有足够的细胞，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对过量或不足，导致假阳性或假阴性结果。因此，每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法，调整细胞与抗体用量，得到最适的细胞/抗体比例。
第七，细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过了长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种：（1）实时的流式检测：利用荧光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放线菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。7-AAD最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC 或PE进行多色标记。但随着时间延长，7AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。（2）手工检测：使用Trypan blue 或其他细胞活性染料。（3）使用专门的仪器进行检测。如Vi-cell.
2、选择和确定单抗组合
流式分析最基本的试剂就是抗体。所选抗体的好坏直接影响结果。影响抗体特性的因素很多，如F/P比值、亚型、全长或片段、种宿来源、标记荧光种类等等。而且，有CD分类号的300多种单抗和大量没有CD分类号的单抗使抗体的选择更加困难。一般，选择抗体组合遵循以下基本原则：1）所选的抗体组合应足够宽，可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。2）对表达少的抗原应尽可能选择荧光强度强的荧光素标记。3）了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式。根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。4）抗体的多种组合可能相互影响与抗原的结合（如通过空间构型的阻碍），所以对所用抗体组合，应先了解每个抗体在对照细胞上单色标记的表达情况。5）对于临床实验尽量选择体外诊断（IVD）试剂和分析特异性（ASR）试剂，而仅供研究用（RUO）试剂一般不能用于体外诊断实验。在我国，用于体外诊断的试剂还必须取得国内的SDA认证。这样，一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型、不同F/P值，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。那么，尽量选择同一家公司的试剂可以减少上述的干扰。对于临床上常见的流式检测项目，所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合。
如，T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。对这一些，一些商业化的公司对常用单抗的检验均推出了一系列质控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（见表一）。
3、染色方法
细胞表面染色：大多数免疫表型分析均采用此方法。但由于许多抗原也同时存在细胞内，所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。表面标记又分溶血前标记和溶血后标记。若红细胞对标记有影响或血浆成分对标记有影响的，适合溶血后标记，但要注意溶血剂膜抗原的影响，所以，溶血剂一般不含固定剂。如免疫球蛋白轻链检测和阵发性血红蛋白尿的检测等。
细胞内染色：有些胞内抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞内染色的关键是使细胞膜通透，把抗体或核酸染料导入胞内而不影响细胞骨架的完整性。还要保证固定和透膜的步骤不影响有关抗原与相应抗体的结合力和核酸与染料的结合。某些适用于胞内染色的试剂可能不适于表面标记分析。通常胞内染色不能与细胞活性的检测同时进行，除非用EMA的方法。对于胞内染色，所用的荧光素应足够小到能穿透到胞膜内。对于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）为活细胞染料，无需固定或透膜。
胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。
三、数据的获取和分析
流式细胞仪数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。由于流式细胞仪是基于对散射光信号和荧光信号进行分析的仪器，因此，仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定直接影响结果。同型对照的设定尤为重要。同型对照是指与单抗种宿来源相同、亚型相同、标记荧光素相同的未免疫动物的免疫球蛋白。同时考虑浓度、F/P值尽量相同，这样阳性阈值的界定才比较准确，特别是对于弱表达抗原阳性率的测定。而DNA倍体分析中参照物的设定非常重要，一般鸡红细胞作为内参照物。为了结果的可靠性，对获取的细胞量至少应在10000-20000个。但不同的实验目的对于获取的细胞量要求一般是不一样的，如DNA倍体分析，至少应获取10000个细胞；微小残留病灶（MRD）的检测，要求达到10-4数量级水平，则应至少分析100000个细胞干细胞移植中CD34的检测，应至少获取100个CD34阳性细胞或75000个有核细胞。
对于获取的数据，应保存在listmode文件中，便于分析。设门（gating）对于流式数据分析至关重要。设门实际就是确定分析区域。在DNA倍体分析中，设门实际就是圈定单个细胞，排除粘连细胞。对于细胞成分单一的标本（如培养细胞），设门比较简单。但对于成分复杂的标本（如骨髓）而言，准确的设门就不那么简单。前向散射光（FS）与侧向散射光（SS）设门干扰因素较多，目前，越来越多的被免疫标记物加散射光设门所取代。如，CD45/SS设门已成为白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34检测、MRD监测最佳的设门方法；CD19/SS设门对于成熟B淋系增生性疾病分析非常适用。
在数据分析中，百分率、荧光强度、DNA指数（DI）、多少个/ul是我们报告中常用的。百分率主要适用于检验指标集中在细胞有无的数量变化。如T细胞亚群检测、网织红细胞检测等；荧光强度主要适用于检验指标的变化集中在细胞上抗原量的多少。如血小板无力症（GT）的检测、慢性淋巴细胞白血病（CLL）CD20的变化等。DI用于DNA倍体分析。而艾滋病划分中外周血CD4的绝对定量、OKT3治疗监测中CD3的绝对定量、干细胞移植中的CD34的定量等等，最终都以多少个/ul的浓度形式表示出来。对于白血病/淋巴瘤免疫分型结果的分析，以前基本上都是以百分率的形式报告临床，但单纯的百分率结果并不能完整的反映肿瘤细胞的特性。因为20%人为认定的阳性判断标准忽略了低于20%的弱阳性结果，以及忽略了阳性结果之间荧光强弱的差别，而这一切对于白血病/淋巴瘤的诊断和分型却非常重要。目前，大多主张以文字描述抗原有无和强弱的报告方式，废弃百分率的报告形式。
四、临床检验的分析过程的质量评价
质量控制也必须重视检验方法学的选择和评价。任何一次实验都一定有误差，在一定意义上可以将误差分为实验方法学的系统误差及除此之外的随机误差。质量控制的方法和手段都只能减少或消除随机误差，但不影响系统误差。要使检验结果的误差控制在临床可接受的低水平或者允许的误差范围内，必须使用总误差水平符合临床要求的检验方法（包括仪器、试剂、具体操作方法等），才能保证检验结果在质量控制下符合临床要求。临床检验质量控制的目的，是监测实验过程中出现重要的误差时，用适当的方法警告分析人员。一般说来，检查实验结果质量的方法是测定质控物，最通用做法是将质控品和病人一起进行常规检验，了解检验质量则是将质控品测定的结果画在控制图上，观测控制结果是否超过控制限来决定失控与否。
在开始使用质控物的第一个月内，检验人员每天将质控物随机插入病人标本中进行检验项目的测定。月末对当月的测定结果（n≥20）做简单统计，求出均值x和标准差s。若检验结果的分布接近正态分布，结果的分布即可用均值和标准差来描述。这就意味着95.5%的结果在x+2s范围内,99.7%的结果在x+3s范围内。为便于观察质控结果，及时了解有何失效情况，常使用质控图。
按照正态分布规律：1)所有测定值应均匀分布于均值两侧，不应有明显不均之感；2)质控品测定值应有95.5%的可能性在x±2s范围之内； 3)不应有连续6次以上的结果落于平均值的一侧；4)不能有连续5次以上的结果有逐渐增高或降低的趋势性变化;5)不应有连续两次结果在x±2s范围之外； 6)没有一次结果在x±3s范围之外。
如果不符合上述规律，则说明结果失控。只有证实当天质控结果在控制之内,对当天的临床检验才能发出结果。一旦出现失控,则须查明原因，重新检验。对有1次检验结果超出均数2个标准差范围，提示警告。同批实验中2个质控品的结果之差值超过4s，也是失控规则之一，提示存在随机误差。连续4次质控结果同方向超出均数1个标准差范围，也是失控规则之一，提示存在系统误差。
五、室间质量评价
开展内部的质量控制使实验的受控项目达到一定的精密度。临床上往往只对实验结果是否可重复较敏感，若实验结果存在较稳定的系统误差，临床和实验室一般不易察觉，因此内部的质量控制还在于控制结果的不精密度。由专门机构定期向临床实验室分发质控品,要求各单位检测后返回测定结果，经过整理和统计，以数据和报告形式反映各实验室间及各分析方法间的差异，根据各单位测定结果与靶值的离散程度，计算出该实验室所的分数，及时反馈给参加者，便于改进工作。这就是室间质量评价的基本形式。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，是对室内质量控制的补充。我国于2000年，由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评。现已开展了T细胞亚群检测和CD34绝对计数的室间质评。

❽ Protein A与Protein G有何不同如何选择一抗和二抗

一抗是能和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。一抗可以特异性地结合底物，识别出我们想要检测的东西。检测任何靶蛋白都有多种抗体可供选择，那如何进行一抗的选择呢？
1）确定实验样本的种属

确定自己实验所用样本的种属，如human、rat、mouse、pig、goat等。应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过。可以通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。如果比对结果，证明同源性比较高的，也可以选择。

（2）确定实验类型

确定自己的实验类型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如未提及并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证。如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

（3）分析 样本蛋白的结构性质

分析了解样本蛋白的结构性质有助于选择合适的抗体，抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FCM流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。

（4）抗体宿主物种的选择

一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，而是选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。

二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如ELISA（以偶联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）,免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）等。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号增强，提高了实验灵敏度。二抗可以偶联有几种不同的标记，可以是酶，荧光素，或生物素。如何选择二抗？通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：

（1）一抗的种属来源

根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。如果一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

（2）一抗是属于哪个类或亚类    

除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。

（3）二抗的种属来源

一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，此时二抗就不能选山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗，就非常适合做类似双标的免疫实验。双标得2个都抗才行，故选择第3个种源的抗体。

（4）选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，Fab片段，还是F(ab')2片段？

整个IgG分子 ：此种抗体适用于多数情况。

Fab 片段 ：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。

F(ab')2 片段 ：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

（5）二抗的偶联标记

一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC,  RRX, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（组织免疫化学，细胞免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。

（6）抗体的纯度

亲和层析纯化的抗体一般更受欢迎，因为这些产品的纯度更高，产生的非特异性背景也少。但是有些情况下也要考虑到纯化过程中损失的IgG部分，因为其中含有亲和力高的抗体，尤其是当目的抗原存在的量较小的时候。

目前，绝大多数的IgG纯化使用Protein A、Protein G亲和层析，它们是来自于不同微生物的蛋白质，对于IgG具有特异性的亲和作用，而对于其他杂蛋白没有或者只有很弱的结合，因此具有极高的选择性。通常，仅凭Protein A、Protein G一步亲和层析就可达到90%的纯度。但是Protein A、Protein G又有什么不同呢？该如何选择呢？

1.Protein A

Protein A是金黄色葡萄球菌表面的蛋白，分子量42kDa，有5个不同的结构域可以结合IgG的Fc片段，具有很强的特异性亲和力，每个Protein A分子至少可以结合两个IgG分子。同时，IgA、IgM或者IgE也有可能和Protein A结合。

nProtein A：天然Protein A，无动物来源组分，载量约30mg人IgG/ml。

rProtein A：重组Protein A ，C-端新增一个Cysteine，可以单一位点定向偶联于琼脂糖基架上，降低与抗体接触的空间位阻，提高了载量，约50mg人IgG/ml。雅心重组蛋白A为本公司自主研发产品，非抗体柱纯化，产品中无任何其它抗体如IgG等的污染；pH耐受范围广，可耐受0.5 M NaOH和0.5M HCl 处理，不降解，抗体结合能力不变。

2. Protein G

Protein G并不是我们熟知的G Protein（细胞表面G蛋白）， 而是G族链球菌的细胞表面蛋白，分子量25kDa，和IgG的Fc区域特异性结合，还能以低亲力与Fab区域特异性的结合，但不与IgA和IgM结合。相比于Protein A，Protein G可以更广泛、更强地、与更多类型的IgG结合，但是载量却较低，约20mg人IgG/ml。

Protein A和Protein G的多个结构域可与IgG结合

Protein A 和 Protein G对于不同物种和亚型的IgG的亲和力如下表；

Protein A与Protein G有何不同？如何选择？ - 知乎 (hu.com)

：超级无敌大蜗牛：https://www.jianshu.com/p/7968913a8432

如何选择一抗和二抗？ - 安必奇生物 (abace-biology.com)

❾ 流式细胞仪分析技术及应用

在2019年的三月份我正式开始做单细胞相关研究工作，有趣的同时也是朋友我们经常误会的是：你是不是用流式细胞术？而我在得知自己要做这单细胞（single cell ）的研究时，在Google搜关键词（single cell ），居然有不少是介绍流式细胞术的。流式细胞术应用到高通量测序领域就变成了微流控技术。可见，把生命科学的视界拉倒单细胞水平的比高通量测序更早的是流式细胞术。

那么在单细胞测序技术出现之前，人们在研究单细胞的时候都是怎么做的呢，都有哪些分析点呢？单细胞测序技术给单细胞研究带来了哪些新的视角？这一切的答案都要求我们对流式细胞术有一个基本的了解。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。

采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

（1） 液流系统
（2） 光学系统
（3） 数据处理系统

激光光源：气冷式氩离子激光器
分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
透镜组：形成平行光，除去室内光
滤片：长通、短通、带通
光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。

荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
线性放大器和对数放大器

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。

FS：反映颗粒的大小
SS：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少

单参数直方图
双参数直方图:点图
二维等高图
假三维等高图
三参数直方图
多参数分析

双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。

双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。
等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。
曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。
等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

①细胞生物学 ：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 [详细]

②肿瘤学 ：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 [详细]

③免疫学 ：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 [详细]
④血液学 ：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 [详细]

⑤药物学 ：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 [详细]

细胞凋亡研究 ：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 [详细]

** 细胞分选**：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 [详细]

** 细胞因子的检测**：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 [详细]

** 血液学应用**：本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等。 [详细]

❿ 第一次做转染试验，请问怎样计算转染率，载体是带GFP的，就是弄不明白是用荧光的个数比上接种细胞总数吗

转染率是大概估计一下，有荧光的占总细胞的比率，如果要精确值可以去做流式。