❶ 生物分子標記
分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用於標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，現在DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用於遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。
分子標記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標記是指可遺傳的並可檢測的DNA序列或蛋白質。狹義分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。
理想的分子標記必須達以下幾個要求：(1) 具有高的多態性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3) 能明確辨別等位基因；(4) 遍布整個基因組；(5)除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布於整個基因組；(6) 選擇中性(即無基因多效性)；(7)檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)；(8) 開發成本和使用成本盡量低廉；(9)在實驗室內和實驗室間重復性好(便於數據交換)。但是，目前發現的任何一種分子標記均不能滿足以所有要求。
【分子標記的種類】
一、基於分子雜交技術的分子標記技術
此類標記技術是利用限制性內切酶解及凝膠電泳分離不同的生物 DNA 分子，然後用經標記的特異 DNA 探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術來揭示 DNA 的多態性。
①限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
1974年Grodzicker等創立了限制性片段長度多態性(RFLP)技術，它是一種以DNA—DNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。RFLP基本原理：利用特定的限制性內切酶識別並切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產生的DNA數目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然後與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化後產生片段在長度上差異。由於不同個體的等位基因之間鹼基的替換、重排、缺失等變化導致限制內切酶識別和酶切發生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。
RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標記位點數量不受限制，通常可檢測到的基因座位數為1—4個。RFLP技術也存在一些缺陷，主要是克隆可表現基因組DNA多態性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。自RFLP問世以來，已經在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應用。
②數目可變串聯重復多態性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )
數目可變串聯重復序列又稱小衛星DNA (MinisatelliteDNA)，是一種重復DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數10一10001不等。VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內切酶的酶切位點必須不在重復序列中，以保證小衛星或微衛星序列的完整性。(2)內切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛星序列所在片段含有較少無關序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復序列片段的多態性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛星序列或微衛星序列，通過分子雜交和放射自顯影後，就可一次性檢測到眾多小衛星或微衛星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。
小衛星標記的多態信息含量較高，在17一19之間。缺點是數量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點。
二、基於PCR技術的分子標記技術
（一）、隨機引物的PCR標記
所用引物的核苷酸序列是隨機的，其擴增的 DNA 區域事先未知。隨機引物PCR擴增的DNA 區段產生多態性的分子基礎是模板 DNA擴增區段上引物結合位點的鹼基序列的突變，不同來源的基因組在該區段上表現為擴增產物有無差異或擴增片段大小的差異。隨機引物PCR標記表現為顯性或共顯性。
①隨機擴增多態性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )
RAPD技術是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法。基本原理：它是利用隨機引物（一般為8—10bp）通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然後用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所使用的引物各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點，一旦基因組在這些區域發生DAN片段插人、缺失或鹼基突變，就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化，從而導致擴增產物數量和大小發生改變，表現出多態性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區域DNA多態性，但利用一系列引物則可使檢測區域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用於對整個基因組DNA進行多態性檢測，也可用於構建基因組指紋圖譜。
與RFLP相比，RAPD具有以下優點：(1)技術簡單，檢測速度快；(2)RAPD分析只需少量DNA樣品；(3)不依賴於種屬特異性和基因組結構，一套引物可用於不同生物基因組分析；(4)成本較低。但RAPD也存在一些缺點：(1)RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；(2)存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但鹼基序列組成不同的DNA片段；(3) RAPD技術中影響因素很多，所以實驗的穩定性和重復性差。
②任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP—PCR)
在AP—PCR分析中，所使用的引物較長(10－50 bp) ，PCR反應分為兩個階段，首先寡核昔酸引物在低嚴謹條件下與模板DNA退火，此時發生了一些合成，以便穩定模板與引物之間相互作用。然後進行高嚴謹退火條件的循環，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退火條件下發生的引物延伸可繼續在高嚴謹條件下擴增。採用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產物，最終反應結果與RAPD類似。只要設計的引物在低嚴謹退火條件下能減少引物產生人為產物，應用成對組合的引物可以產生新的AP—PCR譜帶，但引物配對組合使用時，得到的圖譜與單引物單獨使用時產生的圖譜之和很不相同，這樣，50個引物能產生1250種不同指紋圖譜。
AP—PCR方法不需預知序列資料，而且檢測的基因組樣本是任意的，還能夠用於檢測近等基因系(或同類系)中的多態性。AP—PCR的缺點是每個新的多態性都必須經純化才能進一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長度多態性。
③DNA擴增指紋印跡(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)
DAF是一種改進的RAPD分析技術，與RAPD技術不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短(一般為5一8bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當使用5個核昔酸的引物時，引物和模板的組合大約可擴增出10一100個DNA片段。PCR擴增產物是在凝膠上進行分離，通過銀染即可產生非常復雜帶型。
（二）、特異引物的PCR標記
特異引物的PCR標記所用引物是針對已知序列的 DNA 區段而設計的，具有特定核苷酸序列（通常為 18—24 bp），可在常規PCR復性溫度下進行擴增，對基因組 DNA 的特定區域進行多態性分析。
①序列標志位點(Sequence Tagged Sites，STS)
STS是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統稱。通過設計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結合位點結合，從而可用來擴增基因組中特定區域，分析其多態性。利用特異PCR技術的最大優點是它產生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模糊性。
②簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)
簡單重復序(SSR)也稱微衛星DNA，其串聯重復的核心序列為1一6 bp，其中最常見是雙核昔酸重復，即(CA) n和(TG)n每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目10一60個，其高度多態性主要來源於串聯數目的不同。SSR標記的基本原理：根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由於核心序列串聯重復數目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型並計算等位基因頻率。
SSR具有以下一些優點：(l)一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；(2)微衛星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在採用SSR技術分析微衛星DNA多態性時必須知道重復序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA資料庫查尋則首先必須對其進行測序。
③序列特異性擴增區(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)
SCAR標記是在RAPD技術基礎上發展起來的。SCAR標記是將目標 RAPD片段進行克隆並對其末端測序，根據 RAPD 片段兩端序列設計特異引物，對基因 DNA片段再進行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒別出來。SCAR標記是共顯性遺傳，待檢 DNA間的差異可直接通過有無擴增產物來顯示。SCAR標記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結果穩定性好，重現性高。
④單引物擴增反應(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)
SPAR技術是與RAPD技術相似的一種標記技術，SPAR也只用一個引物，但所用的引物是在SSR的基礎上設計的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進行特異性結合，然後通過P(：R技術擴增SSR之間的DNA序列，凝膠電泳分離擴增產物，分析其多態性。另外，還有一種與SPAR技術非常相似的標記技術，即ISTR ( Inverse Sequence—taggedRepeat)技術，ISTR所用的引物是在反向重復序列基礎上設計的，PCR擴增的是反向重復序列之間的DIVA序列。
⑤DNA單鏈構象多態性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)
SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產生構象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現為電泳遷移率的差別。單鏈DNA構象分析對DNA序列的改變非常敏感，常常一個鹼基差別都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PCR技術定點擴增基因組DNA中某一目的片段，將擴增產物進行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，根據條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結果判定是通過多個樣品之間對比，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個體的DNA特異性，達到指紋分析目的。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplexanalysis，Het)法結合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對鹼基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。對同一靶序列分別進行SSCP和Het分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。
⑥雙脫氧化指紋法(Dideoxy Fingerprints，ddF )
ddF是將雙脫氧末端終止測序法與SSCP結合起來的分析技術，對由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進行SSCP分析。如果目的片段存在一個突變，則所有大於某一大小對應於突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統，對於每一個突有多次機會檢測其遷移率改變，提高了檢測突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時因DNA長度影響SSCP顯示的困難，通過一種雙脫氧核昔酸生產特異性的單鏈DNA，使其中長度合適的DNA片段顯示SSCP改變。
三、基於限制性酶切和PCR技術的DNA標記
①擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )
AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發展起來的一種檢測DNA多態性的新方法。AFLP 是 RFLP 與PCR相結合的產物，其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板 DNA，然後以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最後在接頭互補鏈的基礎上添加1—3個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。引物由三部分組成：與人工接頭互補的核心鹼基序列、限制性內切酶識別序列、引物3』端的選擇鹼基序列（1—10bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個鹼基序列為結合位點。該技術的獨特之處在於所用的專用引物可在知道 DNA信息的前提下就可對酶切片段進行PCR 擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般採用兩個限制性內切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數較少，因而AFLP 分析產生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP 結合了 RFLP 和RAPD兩種技術的優點，具有解析度高、穩定性好、效率高的優點。但它的技術費用昂貴，對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。盡管 AFLP技術誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。
②酶切擴增多態性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )
CAPS技術又稱為PCR—RFLP，它實質上是PCR技術與RFLP技術結合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點的DNA序列資源設計出一套特異性的PCR引物(19—27bp），然後用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色並進行RFLP分析。GAPS標記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標記，其優點是避免了RFLP分析中膜轉印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由於很多限制性內切酶均可與擴增DNA酶切，所以檢測到多態性機會較大。
四、基於DNA晶元技術的分子標記技術
核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)
SNP標記是美國學者LanderE於1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP 標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異。人類基因組大約每 1000 bp SNP出現一次，已有2000多個標記定位於人類染色體，對人類基因組學研究具有重要意義。檢測 SNP 的最佳方法是 DNA 晶元技術。SNP被稱為第三代 DNA 分子標記技術，隨著 DNA 晶元技術的發展，其有望成為最重要最有效的分子標記技。
【分子標記的應用領域】
（一）、基因組作圖和基因定位研究
長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據諸如形態、生理和生化等常規標記來構建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數種類的生物，而且圖譜解析度大多很低，圖距大，飽和度低，因而應用價值有限。分子標記用於遺傳圖譜構建是遺傳學領域的重大進展之一。隨著新的標記技術的發展，生物遺傳圖譜名單上的新成員將不斷增加，圖譜上標記的密度也將越來越高。建立起完整的高密度的分子圖譜，就可以定位感興趣的基因。
（二）、基於圖譜克隆基因
圖位克隆(Map—bascdcloning))是近幾年隨著分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發展起來的一種新的基因克隆技術。利用分子標記輔助的圖位克隆無需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表達產物，就可以直接克隆基因。圖位克隆是最為通用的基因識別途徑，至少在理論上適用於一切基因。基因組研究提供的高密度遺傳圖譜、大尺寸物理圖譜、大片段基因組文庫和基因組全序列，已為圖位克隆的廣泛應用鋪平了道路。
（三）、物種親緣關系和系統分類中的應用
分子標記廣泛存在於基因組的各個區域，通過對隨機分布於整個基因組的分子標記的多態性進行比較，就能夠全面評估研究對象的多樣性，並揭示其遺傳本質。利用遺傳多樣性的結果可以對物種進行聚類分析，進而了解其系統發育與親緣關系。分子標記的發展為研究物種親緣關系和系統分類提供了有力的手段。
（四）、用於疾病診斷和遺傳病連鎖分析
1980年，Bostein等成功的將PFLP技術用於鐮刀型貧血症的診斷分析，開創了基因診斷的先河。PFLP是以孟德爾方式遺傳，因此可以作為染色體上致病基因座位的遺傳標志。目前，許多與相連鎖的致病基因得以定位。小衛星和微衛星因其高度多態性而被廣泛用於疾病診斷和遺傳病的連鎖分析。隨著高通量SNP檢測技術方法的出現，作為數量最多且易於批量檢測的多態標記，SNP在連鎖分析與基因定位，包括復雜疾病的基因定位、關聯分析、個體和群體對環境致病因子與葯物的易感性研究中將發揮愈來愈重要的作用。
【分子標記技術的展望】
目前，分子標記技術已飛速發展，並被廣泛應用於動植物的遺傳研究中。分子標記中的已在玉米、大豆、雞、豬等動植物育種和生產中有許多應用研究，主要集中在基因定位、輔助育種、疾病治療等方面的應用研究工作，取得了一些應用成果。分子標記技術的開發是近年來分子生物學領域研究的熱點。隨著分子生物學理論與技術的迅猛發展，必將研發出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記技術。而分子標記技術與提取程序化、電泳膠片分析自動化、信息(數據)處理計算機化的結合，必將加速遺傳圖譜的構建、基因定位、基因克隆、物種親緣關系鑒別及與人類相關的致病基因的診斷和分析。