⑴ pcr技術的四種原料是什麼
pcr技術的四種原料是dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶。
引物有多種設計方法,由PCR在實驗中的目的決定,但基本原則相同。PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。
模板即擴增用的DNA,可以是任何來源,但有兩個原則,第一純度必須較高,第二濃度不能太高以免抑制。
緩沖液的成分最為復雜,除水外一般包括四個有效成分:緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;一價陽離子,一般採用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子。
二價陽離子,即鎂離子,根據反應體系確定,除特殊情況外不需調整;輔助成分,常見的有DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。
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標準的PCR過程分為三步:
1、DNA變性:(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
2、退火:(60℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。
3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。如圖所示:現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。