⑴ 我急需1篇中等水平檢驗醫學的綜述
【摘要】 檢測限是檢測方法的重要性能指標，用Poisson分布的概率函數分式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體出現該結果的概率。以實時熒光定量PCR(FQ�PCR)檢測乙型肝炎病毒DNA結果為例，計算可知，一次抽樣反應管的檢測結果≥4時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而檢測血清中病原體時擴增反應管中的檢測限是4拷貝/ul計算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結果為0的概率可達0.368，結果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結果為0的概率為0。結果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/L表示一次抽樣結果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。
【關鍵詞】 實時熒光定量PCR；檢測限；統計推斷
Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Real�time Fluorescence Quantitative PCR
Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deced.For example,in Real�time Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.
Key words：Real�time Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation; Statistical conclusion
檢測限是檢測方法的重要性能指標，只有在檢測報告中明確表達了檢測方法的檢測限，該檢測報告在各實驗間及同一項目的各種檢測方法間才可進行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統的檢測限。當前，檢測限術語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等〔1〕。每個詞語的實際含義中包含有各自的實驗方式、數據處理方式及由數據作出的推論等。我們採用統計學方法，以期得到一致的實時熒光定量PCR(Real�time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ�PCR)檢測限，現介紹如下。
1 文獻中FQ�PCR檢測限的描述
檢測乙型肝炎病毒DNA的文獻中檢測限使用了「最低檢出量」〔2，3〕、靈敏度〔5～7〕等術語，它等於已知的高拷貝HBV DNA血清10倍系列稀釋後能檢測到擴增曲線的最大稀釋倍數管濃度。表述有：陰性HBV DNA≤106拷貝/升〔4〕；熒光定量PCR法檢測靈敏度102拷貝/ml〔5〕、104拷貝/ml〔6〕、8.6×102拷貝/ml〔7〕；HC�Ⅱ法檢測靈敏度1.4×105拷貝/ml〔7〕；103 Eq/ml理論值時到達檢測極限〔3〕；PCR�FP檢測HBV DNA的最低檢測出量1×101拷貝〔2〕；bDNA在105 Eq/ml時到達檢測極限〔3〕。以上檢測限術語各不相同，且同一方法檢測HBV DNA在上述各實驗室發出同樣的「HBV DNA低於檢測下限」的報告時其實際HBV DNA拷貝數相差可達100倍。
2 FQ�PCR檢測過程簡介
以測定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40 μl血清樣本加40 μl DNA提取液處理後，將其中2 μl（相當於1 μl血清）加入主反應液（含DNA引物、酶、DNA構件分子dNTP等）管中，在自動熱循環上進行溫度循環，自動熱循環儀記錄每一反應管在每一次溫度循環的熒光強度，記30次溫度循環後結束。在PCR循環過程中，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數稱為Ct值（Cyclethreshold),它與反應管中DNA起始拷貝數的對數值（lgN)呈非常顯著的直線相關關系。自動熱循環儀對標准樣品自動生成一條Ct值對於起始拷貝數值（lgN)的工作曲線，並通過該工作曲線來確定待測未知樣品反應管的起始拷貝數（N）。當30次循環後某一待測管仍檢測不到高於基線水平的熒光信號時，儀器默認Ct值為30，不計算起始拷貝。
3 確定FQ�PCR檢測限的統計學原理
如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應量的波動服從正態分布規律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定。可信限為95%時檢測限＝x空白+2.s空白；可信限為99.7%時檢測限=x空白+3.s空白。這是目前多數檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應是一致的〔1〕，FQ�PCR檢測限也應是推論總體與空白有統計學差異的最小抽樣結果。
4 FQ�PCR檢測限的統計推斷
假設病原體在血液等體液中的分布是隨機的，則單位體積中(如1.0 μl)病原顆粒數的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數公式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測定技術測定病原體核酸序列的量可低至1個拷貝〔2〕。例如：血清標本中加入等量的DNA提取液，於離心管中煮沸，4 ℃放置，離心，吸取上清液2 μl作模板 進行擴增檢測(2 μl上清液相當於抽樣1 μl血清)〔2〕，其中至少有1個拷貝的HBV DNA才能有典型擴增反應，這時檢測結果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數公式可計算出1次抽樣檢測結果出現0時，推斷總體為1～9的概率見表1。
表1 總體為1～9時抽樣為0的概率及總體（略）
在FQ�PCR檢測HBV DNA中，當30次循環後某一待測管仍檢測不到高於基線水平的熒光信號(即當Ct≥30)，反應管檢測結果為0時，推論總體拷貝數為1～9的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時報告0拷貝的可信限度低於50%)。總體為1時一次抽樣結果分別為1～9時的概率見表1。當一次抽樣結果≥4時，推論總體為1的概率≤0.015 33，所以對於病原體的檢測，一次抽樣反應管檢測結果≥4拷貝時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而上述檢測血清中病原體時一次抽樣反應管的檢測限是4拷貝/μl。當總體為1、2、3時一次抽樣結果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質量評價樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時，無論實驗室實際檢測質量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實驗室檢測結果為0而被判為不符合〔按靶值的對數值GM±0.5 log(10)〔9〕作為可接受的定量范圍〕。2005年衛生部室間質量評價中靶值為1.51拷貝數/μl的樣本符合率僅35.2%；Mancini C 等〔9〕報道一些實驗室對檢測下限附近的樣本(3.00 log IU/ml)准確定量有困難；Raggi CC等〔10〕也報道28.6%的實驗室(12/42)對最低濃度的樣本不能定量。這些都是因為檢測下限附近的樣本一次抽樣結果為0的概率太大所致，對此我們將另文詳細討論。造成上述文獻中檢測限差異較大的可能原因如下：用於10倍系列稀釋的已知高拷貝HBV DNA血清本身拷貝數的差異；對檢測限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測到典型擴增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述HBV DNA檢測中，抽樣單位是1 μl血清〔如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 μl上清液相當於實際含12.5 μl血清，則抽樣單位也只是12.5 μl〕，而報告結果的單位是ml甚至L。當總體為1拷貝/μl時表示一次抽樣結果為0的概率達0.368，結果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時表示一次抽樣結果為0的概率為0，結果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997(Poisson分布總體>50時近似正態分布，范圍是X±uα*√X，可信限為99.7%時uα=3);總體為100 000拷貝/L時表示一次抽樣結果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。文中推理以HBV�DNA的FQ�PCR檢測為例，其他病源體核酸的FQ�PCR檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應管的檢測限4拷貝/反應管；如反應管中加入模板量相當於12.5 μl血清則檢測限相當於0.32拷貝/ μl。此推斷僅是針對FQ�PCR技術本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數進行討論。
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