㈠ CRISPR-Cas9基因編輯技術簡介
CRISPR-Cas9是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出後的第三代基因編輯技術，短短幾年內,CRISPR-Cas9技術風族歷靡全球, 成為現有基因編輯和基因修飾裡面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術之一，成為當今最主流的基因編輯系統。
一、什麼是CRISPR-Cas系統
CRISPR-Cas系統是原核生物的一種天然免疫系統 。某些細菌在遭到病毒入侵後，能夠把病毒族穗扒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。
C RISPR-Cas系統包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關聯基因）兩部分。
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1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因組內的一段重復序列 。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的規律性間隔的短迴文重復序列）。分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古細菌當中。 （註：生活在深海的火山口、陸地的熱泉以及鹽鹼湖等極端環境中，有一些獨特結構的細菌，稱為古細菌）
CRISPR基因序列主要由前導序列（leader）、重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）構成 。
①前導序列 ：富含AT鹼基，位於CRISPR基因上游， 被認為是CRISPR序列的啟動子 。
②重復序列 ：長度約20–50 bp鹼基且包含5–7 bp迴文序列，轉錄產物可以形成發卡結構， 穩定RNA的整體二級結構 。
③間隔序列 ： 是被細菌俘獲的外源DNA序列 。這就相當於細菌免疫兆昌系統的「黑名單」，當這些外源遺傳物質再次入侵時，CRISPR/Cas系統就會予以精確打擊。
2、Cas基因位於CRISPR基因附近或分散於基因組其他地方，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（ CRISPR associated，Cas ）。
Cas基因編碼的Cas蛋白在防禦過程中至關重要，目前已經發現了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。
依據Cas蛋白在細菌免疫防禦過程中參與的角色，目前將CRISPR-Cas系統分為兩大類。
第一大類 ：它們切割外源核酸的效應因子為多個Cas蛋白形成的復合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。
第二大類 ：它們的作用因子是比較單一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。
目前，被最為廣泛應用的CRISPR系統是II型CRISPR-Cas系統，也就是CRISPR-Cas9系統。
二、CRISPR-Cas9的作用原理
對於CRISPR-Cas9的作用機理可以分為三個階段來理解。
1、第一階段：CRISPR 的高度可變的間隔區的獲得 （ 俘獲外源DNA，登記「黑名單」 ）
CRISPR 的高度可變的間隔區獲得，其實就是指外來入侵的噬菌體或是質粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因組，整合的位置位於CRRSPR 的5' 端的兩個重復序列之間。因此，CRISPR 基因座中的間隔序列從5' 到3' 的排列也記錄了外源遺傳物質入侵的時間順序。
新間隔序列的獲得可能分為三步：
第1步：Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描入侵的DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原型間隔序列。
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第2步：Cas1/2蛋白復合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。
第3步：DNA會進行修復，將打開的雙鏈缺口閉合。這樣一來，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。
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2、第二階段：CRIPSR 基因座的表達（包括轉錄和轉錄後的成熟加工）
CRISPR序列在前導區的調控下轉錄產生pre-crRNA（ crRNA的前體 ），同時與pre-crRNA序列互補的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被轉錄出來。pre-crRNA通過鹼基互補配對與tracrRNA形成雙鏈RNA並與Cas9編碼的蛋白組裝成一個復合體。它將根據入侵者的類型，選取對應的「身份證號碼」（ 間隔序列RNA ），並在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的協助下對這段「身份證」進行剪切，最終形成一段短小的crRNA（ 包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復序列區 ）。
crRNA，Cas9以及tracrRNA組成最終的復合物，為下一步剪切做好准備。
3、第三階段：CRISPR/Cas 系統活性的發揮（靶向干擾）
crRNA，Cas9以及tracrRNA組成最終的復合物就像是一枚制導導彈，可以對入侵者的DNA進行精確的打擊。這個復合物將掃描整個外源DNA序列，並識別出與crRNA互補的原間隔序列。這時，復合物將定位到PAM/原間隔序列的區域，DNA雙鏈將被解開，形成R-Loop。crRNA將與互補鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態。
隨後，Cas9蛋白精確的平端切割位點位於PAM上游3個核苷酸位置，形成平末端產物。Cas9蛋白的HNH結構域負責切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結構域負責切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA的表達被沉默，入侵者被一舉殲滅。
三、 CRISPR-Cas9基因編輯技術及應用…
tracrRNA-crRNA在被融合為單鏈向導RNA（sgRNA）時也可以發揮指導Cas9的作用。
CRISPR-Cas9基因編輯技術就是通過人工設計的 sgRNA（guide RNA）來識別目的基因組序列，並引導 Cas9 蛋白酶進行有效切割 DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷後修復會造成基因敲除或敲入等，最終達到對基因組DNA 進行修飾的目的。
CRISPR-Cas9的廣泛應用
1、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細胞會採用高效的 非同源末端連接 方式（NHEJ）對斷裂的DNA進行修復。但是，在修復過程中通常會發生鹼基插入或缺失的錯配現象，造成移碼突變，（ 移碼突變 ：是指DNA分子由於某位點鹼基的缺失或插入，引起閱讀框架變化，造成下游的一系列密碼改變，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標基因失去功能，從而實現基因敲除。為了提高CRISPR系統的特異性，可將Cas9的一個結構域進行突變，形成只能對DNA單鏈進行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設計兩條sgRNA序列，分別靶向DNA互補的兩條鏈，這樣兩條sgRNA特異性的結合靶標序列，即可形成DNA斷裂，並在修復過程中通過移碼突變實現基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
當DNA雙鏈斷裂後，如果有DNA修復模板進入到細胞中，基因組斷裂部分會依據修復模板進行 同源重組修復 （HDR），從而實現基因敲入。修復模板由需要導入的目標基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈，也可以是雙鏈DNA質粒。HDR修復模式在細胞中發生率較低，通常小於10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學家致力於提高HDR效率，將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期，促進修復方式以HDR進行；或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ，提高HDR的效率
3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特點是能夠自主結合和切割目的基因，通過點突變的方式使Cas9的兩個結構域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9隻能在sgRNA的介導下結合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結合到基因的轉錄起始位點，可以阻斷轉錄的開始，從而抑制基因表達；將dCas9結合到基因的啟動子區域也可以結合轉錄抑制/活化物，使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在於，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，並不會對基因組DNA造成永久性的改變。
4、多重編輯（Multiplex Editing）
將多個sgRNA質粒轉入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的准確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質粒上可以構建2～7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。
5、功能基因組篩選
利用CRISPR-Cas9進行基因編輯可以產生大量的基因突變細胞，因此利用這些突變細胞可以確認表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導致的。基因組篩選的傳統方法是shRNA技術，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結果。CRISRP-Cas9系統的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優勢，在基因組篩選中得到了廣泛的應用。目前CRISPR的基因組篩選功能應用於篩選對表型有調節作用的相關基因，如對化療葯物或者毒素產生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。
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