免疫印跡技術有哪些

Ⅰ 免疫學的檢測方法

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫測定。
1． 體液免疫測定主要利用抗原與相應抗體在體外發生特異性結合，並在一些輔助因子參與下出現反應，從而用已知抗原或抗體來測知未知抗體或抗原。此外，尚包括檢測體液中的各種可溶性免疫分子，如補體、免疫球蛋白、循環復合物、溶菌酶等。
2． 細胞免疫測定法是根據各種免疫細胞（T細胞、B細胞、K細胞、NK細胞及巨噬細胞等）表面所具有的獨特標志和產生的細胞因子等，測定各種免疫細胞及其亞群的數量和功能，以幫助了解機體的細胞免疫水平。
體液免疫檢測法
1.凝集反應。
顆粒性抗原（細菌或紅細胞等）與相應抗體特異性結合，在電解質參與下形成肉眼可見的凝集物，稱之為凝集反應。
1）直接凝集反應。顆粒性抗原與相應抗體直接結合所產生的凝集現象，前者多為細胞表面的結構成分，如細菌或紅細胞的表面結構抗原。⑴玻片法：多用於抗原的定性檢測。⑵試管法：多用於抗體的定量檢測。
2）間接凝集反應。將可溶性抗原吸附於載體顆粒（如乳膠顆粒、紅細胞等）的表面，稱之為致敏顆粒。當致敏顆粒與相應抗體結合，即可出現凝集現象。這個反應常用於測定細菌性抗體、病毒性抗體、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體抗體及某些自身抗體（如抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等）。
根據凝集反應的原理，還有間接凝集抑制試驗、反向間接凝集試驗、協同凝集試驗等。
2．沉澱反應。
可溶性抗原（外毒素、血清、細菌培養的濾液、組織浸出液等）與相應抗體特異性結合，在電解質參與下，形成沉澱物，稱為沉澱反應。沉澱反應的抗原多為多糖、類脂、蛋白質等。
1）單向擴散試驗。這是一種抗原定量試驗，是可溶性抗原在含抗體的瓊脂介質中擴散的沉澱反應。此法常用於檢測血清免疫球蛋白和補體各成分的含量。
2）雙向擴散試驗。這是可溶性抗原與抗體在瓊脂介質中相互擴散的沉澱反應。本法常用於定性試驗，如檢測血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。單克隆抗體技術
3）對流免疫電泳。對流電泳是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。此法常用於檢測血清中的乙型肝炎表面抗原與甲胎蛋白等。
3．中和試驗。
特異性抗體可抑制相應抗原物質的活性，抗體使相應抗原的毒性或傳染性消失的反應為中和試驗。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗體可使病毒失去感染性等。診斷風濕熱的抗鏈球菌溶血毒素「O」試驗也為一種中和試驗。乙型溶血性鏈球菌能產生一種溶解人、兔紅細胞的溶血毒素「O」，該毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素「O」抗體所中和而不出現溶血。試驗時將病人血清與溶血毒素「O」混合，作用一段時間後加入人紅細胞，紅細胞不被溶解為陽性反應，表示病人血清中存在抗溶血毒素「O」抗體。血清抗體效價達400單位以上時提示患者曾感染乙型溶血性鏈球菌，有助於風濕熱的診斷。
4.免疫熒光法（熒光抗體法）。
是應用熒光素染料（如異硫氰酸熒光黃等）來標記抗體，但不影響其活性，此種抗體稱熒光抗體。用已知種類的熒光抗體浸染待檢的含有抗原的細胞或組織切片，如有相應抗原存在，則抗原即與此種抗體發生特異性結合，形成復合物而粘著在細胞上，不易洗脫，在熒光顯微鏡下成為發出熒光的可見物，可達到診斷或定位的目的。包括直接法和間接法。
5．酶聯免疫吸附試驗。
本法的原理是利用酶（常用辣根過氧化物酶）標記的抗原或抗體，以測定被檢標本中有無相應的抗原或抗體。有間接法、雙抗體法、競爭法三種。
6．溶血空斑試驗。
7．免疫印跡技術。
免疫印跡或免疫轉印技術(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)
抗體抗原反應
創建的DNA印跡術(Southernblotting）基礎上發展起來的新型免疫生化技術。
細胞免疫檢測法
近代免疫學廣泛採用了細胞生物學、免疫血清學、免疫標記、免疫組化等多方面技術，不斷發展和完善了一系列細胞免疫檢測技術，用於檢測各類免疫細胞的表面標志（包括抗原及受體）、細胞的活化、增殖、吞噬、殺傷功能、各種細胞因子的活性或含量等方面。這些技術為深入研究和認識機體免疫系統的生理、病理改變，闡明某些疾病的發病機制和臨床診治提供了有用的手段。隨著細胞免疫學的迅猛發展，時有新的細胞免疫檢測技術出現。二十一世紀初期，新發展的項目集中在對有關細胞因子以及細胞受體方面的檢測。
1．淋巴細胞轉化試驗。
人類淋巴細胞在體外與特異性抗原（如結核菌素）或非特異性有絲分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T細胞即被激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加，最後導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴母細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀來確定摻入量以確定淋巴細胞轉化率。2000年開始出現一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱為MTT檢測法。MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色成分。該產物的多少與活細胞數成正比，結果可用酶標儀(595nm）測量光密度，作為MTT法的指標。
2．E-花環法。
人類T細胞表面有羊細胞受體(CD2）能與羊紅細胞結合形成玫瑰花樣結構。即將分離液分離出的外周的單個核細胞懸液與羊紅細胞在體外混合，經37℃培養5～10分鍾後放4℃過夜，取細胞懸液計數，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結成花環即為T細胞，此法可用來分離T細胞。
3．T細胞亞群檢測。
4．細胞毒試驗。
Tc細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞等對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。
抗體制備
常用的檢測方法是51Cr（鉻）釋放法，將51Cr-Na2CrO4鹽水溶液與靶細胞（不同的細胞需不同的靶細胞，如NK細胞的靶細胞為K562），於37℃培養1小時左右，51Cr即進入靶細胞，與胞漿結合，洗去游離的51Cr後，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待測細胞毒的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50:1或100:1），靶細胞殺傷越多，釋放到上清液中的游離51Cr就越多，且不能再被其他細胞吸收，用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，可計算出待檢細胞殺傷活性高低。細胞毒的檢測對腫瘤免疫有較大價值。
5．巨噬細胞吞噬功能的測定。
將中葯(10%斑蝥）乙醇浸出液浸漬的濾紙（1cm2大小）置於受試者前臂屈側皮膚上，4～5小時後取下濾紙。48小時內皮膚局部可水泡，內含巨噬細胞。取水泡液0.5ml加雞紅細胞懸液0.01ml，37℃經30分鍾後作塗片、染色與鏡檢，計算吞噬百分率及每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的平均數。本試驗有助於腫瘤病情及療效的觀察。
6．移動抑制試驗。
致敏淋巴細胞與其特異性抗原再次接觸時，可以產生移動抑制因子(MIF）。這種因子可以抑制巨噬細胞和中性粒細胞的移動，使之定位於局部而增強其免疫作用。本試驗用來觀察受檢者淋巴細胞在體外受特異性抗原刺激後，有無MIF產生，以測定機體對某種抗原的特異性細胞免疫反應的功能。
7．時間分辨熒光測量技術。
時間分辨熒光測量技術(time-resolvedfluorometry,TrF）是一項新型的超微量非放射性分析技術。該技術的敏感性和特異性與放射性核素測量技術相仿，但無放射測量的弊端，故問世雖短，進展卻極為迅速，有取代放射測量之勢。
8．細胞因子檢測技術。
細胞因子的檢測，2005年起在中醫臨床及實驗室中已廣泛應用。
9．細胞受體的檢測。
受體是細胞表面標志之一，通過對受體的檢測，可以了解細胞的功能，並為某些疾病的發病機制提供一定的理論依據。

Ⅱ 免疫學技術知識總結 第三章

第三章 經典免疫學技術

第一節 沉澱反應

一、沉澱反應的原理

沉澱反應：可溶性抗原與相應抗體在溶液或者凝膠中特異性結合後，如果兩者比例合適，可相互作用形成不溶性的免疫復合物，出現肉眼可見的不溶性沉澱物。（比例合適時，由分子熱運動引起。）

二、沉澱反應的類型

（一）溶液中的沉澱反應

是指在清澈透明的特異當中，呈現溶解狀態的抗原與抗體在試管內或凹薄片上混勻，可凝聚成為肉眼可見的須狀或顆粒狀的不溶性物質。

溶液中沉澱反應有：

1.     絮狀沉澱反應

絮狀沉澱法就是指將抗原與抗體相結合之後在適當的電解質存在條件下，抗原抗體形成肉眼可見的絮狀沉澱物。

特點：方法受抗原抗體比例的影響顯著；應用於測定抗原抗體反應的合適比例上。

絮狀沉澱法的三種方法：

抗原稀釋法：抗原最適比例

抗體稀釋法：抗體最適比例

方陣滴定法：抗原抗體最適比例

2.     環狀沉澱反應

環狀沉澱法是又叫毛細管內沉澱反應，是常見的一種檢測抗原抗體濃度的方法。在毛細管內，上面是抗原，下面是抗體，中間有一道平衡區即為沉澱，但假如不同種抗原或者抗體之後，就會發現不同濃度的抗原抗體所形成的環狀沉澱位置不同。抗原濃度越高，抗體濃度越低，出現的的沉澱越接近管底部。

1.     免疫比濁法

免疫比濁法的基本原理是：當抗原與抗體在特殊稀釋系統中反應而且比例合適時，形成的可溶性免疫復合物在稀釋系統中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應液出現濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應液的濁度也隨之增加。通過測定反應液的濁度與一系列標准品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。

優點在於：矯正曲線穩定、簡便快速、已與自動化、沒有放射性核素污染。缺點在於靈敏度差，特異性較差。

免疫比濁法的分類：透射比濁法、散射比濁法、免疫膠乳濁度測定法、速率抑制免疫比濁法

2.     免疫沉澱技術（經典免疫學沉澱技術）

加入特異性抗體、沉澱試劑形成混合抗原，離心沉澱之後沉澱抗原，經過電泳分離之後放射自顯彰。

3.     免疫共沉澱技術

免疫共沉澱技術的原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose

beads上的蛋白質A的抗體免疫沉澱A蛋白，那麼與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉澱下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。

優點在於：1.可以檢測細胞內相互作用蛋白質的天然活性，2.檢測證實細胞環境中的蛋白質相互作用，3.獲得天然狀態下的相互作用的蛋白質復合物。

免疫共沉澱的局限性在於：1.難以檢測低親和力和短暫的相互作用。2.不能確切的分辨第三種蛋白的橋聯作用。3.靈敏度不如親和色譜高。4.需要對未知蛋白有一定新的了解。

免疫沉澱的應用范圍：應用於蛋白質相對含量的測定，蛋白質修飾水平等分析，蛋白質相互作用的研究。

（二）凝膠中的沉澱反應

1.     單向免疫擴散實驗：在瓊脂糖中加入抗體，形成抗體凝膠，抗原加入後，抗原根據濃度大小自由擴散，與抗體形成沉澱環，抗原濃度越大，沉澱環越大。

2.     雙向免疫擴散試驗：抗原抗體都會發生擴散，但兩者相互擴散形成沉澱線之後就表示出了濃度，形成的沉澱線離抗原越近，說明抗原的濃度越大。

3.     免疫電泳：免疫電泳法是將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然後加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而使其相遇，在二者比例適當的地方，形成肉眼可見的沉澱弧。多用來分析抗原比較復雜的抗原復合物。

4.     火箭電泳試驗：凝膠含有抗體，叫抗原跑膠之後形成峰值，峰值越高，說明抗原濃度越高。

5.     免疫印跡技術：WB將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離, 然後取固定化基質膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉移到印跡紙上, 並且固相化。最後應用免疫覆蓋液技術如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對抗原固定化基質膜進行檢測和分析。

第二節 凝集反應

一、凝集反應原理

凝集反應：顆粒型抗原與相應抗體結合，在適當電解質純愛下，形成肉眼可見的凝集團塊。凝集原和凝集素

凝集反應的特點：

1.

凝集反應中抗原顆粒較大，長期浸漬或者沉澱可以自然沉降。

2.凝集反應中凝集塊主要由抗原組成，沉澱反應中沉澱塊主要有抗體組成。

3.在您肌膚那英中，需要稀釋免疫血清中的抗體，是抗體不至於過多；而在沉澱反應中，為了防止抗原過多們一般都會稀釋抗原（即沉澱反應中的抗體過量，凝集反應中一般都是抗原過量）

二、凝集反應的類型

1.直接凝集反應：是將細菌或紅細胞與其相應抗體結合產生的細菌凝集或者紅細胞凝集。

（1）微生物凝集反應：肥達式反應，用已知的傷寒桿菌O、H抗原與甲乙型副傷寒桿菌H抗原，與病人的血清做定量凝集試驗，一測定患者血清中無相應抗體的存在，作為傷寒、副傷寒的診斷參考。

（2）同種紅細胞凝集反應：血型檢驗

2.間接凝集反應：將可溶性抗原（或抗體）包被在不溶性顆粒表面，與響應抗體（或抗原）在適宜條件下結合形成凝集團塊。

反應類型：

（1）正向間接凝集反應：將抗原先吸附在載體表面，然後與相應的抗體結合產生的凝集反應。

（2）反向間接凝集反應：將特異性抗體先結合在載體表面，然後與相應的抗原發生凝集反應。

（3）間接凝集抑制反應：先將可溶性抗原（或抗體）與相應的抗體（或抗原）混合，然後再加入抗原（或抗體）致敏的載體顆粒，若出現凝集現象，則說明標本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結合。

3.橋梁凝集反應：也就相當於二抗的應用

4.共同凝集反應：抗原抗體都是顆粒型，又稱為協同凝集反應，指由兩種顆粒成分相互作用而發生的凝集反應。

（1）細菌共同凝集反應：金黃色葡萄球菌與IgG抗體結合之後形成抗體致敏的SPA，與抗原結合之後通過協同凝集形成細菌共凝集。

（2）玫瑰花結試驗：常見的有E花結、EA花結和EAC花結。E花結是由內綿陽血紅細胞和T細胞以及50%的NK細胞；E花結是由抗體致敏的紅細胞與B、T、NK、粒細胞、單核巨噬細胞共同組成；EAC花結是由補體致敏細胞和B細胞組成。

第三節 補體參與的抗原抗體反應

一、補體參與的抗原抗體反應的原理：利用補體來測定反應體系中抗原抗體的存在情況，並通過紅細胞裂解與否進行示蹤。

二、補體參與的抗原抗體類型

1.補體參與直接的抗原抗體反應：

（1）溶血反應：能從反應系統中50%的致敏綿羊紅細胞發生溶血的血清的量，即為每毫升血清中補體的含量。

（2）溶菌反應每毫升血清中補體的含量=1/血清用量×稀釋倍數

2.補體參與簡潔的抗原抗體反應：溶菌反應常作為某血清中是否含有相應抗體的檢測方法。

（1）補體結合試驗；華氏反應，基本原理為含有抗體的血清再加入抗原、補體、溶血素之後不會發生裂解。但是不含有抗體的血清再加入一系列物質之後會發生裂解。只加入抗原或者抗體都會不發生裂解。

（2）被動紅細胞溶血試驗：吸附抗原的紅細胞在有相應抗體和補體的情況下出現了紅細胞溶解的現象。

（3）溶血空斑試驗：是一種測定B細胞產生和蜂蜜抗體功能呢個的體外實驗。

直接溶血空斑試驗：脾臟淋巴細胞在綿陽血紅細胞瓊脂上培養，加入補體之後，會與抗原抗體結合，紅細胞溶解形成空斑。

間接溶血空斑試驗：一般用於測定溶血效率較低的IgG或者IgA抗體，夫納音過程中需要加入抗球蛋白抗體輔助溶血空斑的形成。

改良型溶血空斑試驗：將直接溶血空斑試驗分別用致敏紅細胞和淋巴細胞代替，加入補體之後形成空斑。

反向溶血空斑試驗：二抗對一抗的廣增反應。

第四節 中和反應

一、中和反應的原理：即將被檢血清與病原微生物混合，經過適當時間作用後，接種到宿主系統（包括動物、級配或者培養細胞），按照對其產生的保護效果的差異，可以判斷該微生物或毒素是否被綜合，並計算出綜合的程度。

有中和抗體和抗毒素

二、中和反應的類型

1.終點法中和反應：根據地定被血清中和後的參與獨立，來判斷血清中中和抗體的效價。中和指數=實驗組LD50/對照組LD50

（1）固定病毒稀釋血清發：線固定病毒的毒價，再與等量的遞進稀釋的待測血清混合。

（2）固定血清稀釋病毒法：先將病毒原液做10被遞進稀釋，分別與等量的正常血清、待測血清混合，計算中和指數。

2.蝕斑減少中和反應

抗體效價為：蝕斑數較少50%的血清稀釋度