什麼是黃龍病pcr技術

❶ 目前檢測柑橘黃龍病的常用方法是什麼

中南農業科技開發研究所果樹黃龍病科研室介紹，檢測柑橘黃龍病的常用方法如下：
柑桔黃龍病的檢測是一個從傳統生物學向分子生物學、從定性檢測到定量檢測的發展過程。從觀察病狀，生物鑒定，電鏡與超薄切片技術，血清反應，到PCR反應等技術，對黃龍病診斷和檢測的研究，經歷了很長時間，取得很大的進步。目前，使用PCR技術診斷黃龍病，已達到快速、准確的定性與定量的要求。

1、田間診斷
研究柑桔黃龍病的困難，在於它的病原無法人工培養｡因此,長期以來對黃龍病的診斷,主要依據典型的黃梢和葉斑駁症狀｡柑桔感染黃龍病後，全年均可表現症狀，在田間以夏梢、秋梢發病最多，其次是春梢。新抽出的病梢, 其葉片不能正常轉綠, 表現均勻黃化或呈斑駁症狀。這樣症狀是十分明顯和較為特異的, 具有診斷的脊握價值。目前，主要選擇各個新梢的成熟期，特別是在每年的10～12 月秋梢成熟以後，症狀表現的最適期間，根據當年春梢葉片的斑駁症狀來診斷田間的黃龍病病樹，可以達到相當可靠的程度。但是，症狀的發展過程會受到環境條件的影響。例如在果園管理不良、營養缺乏或其他病蟲危害嚴重的情況下，病樹若不表現典型症狀則難以診斷。這也是造成對黃龍病有種種混淆看法的一個主要原因。因此，症狀診斷必要時要與鑒別寄主(蘆柑) 的生物學測定相結合。

2、電鏡觀察
自1 977～1978年間利用電鏡與超薄切片技術，在柑桔黃龍病病樹葉片的篩管細胞內發現病原類細菌以來（柯1979、陳作義1979 1980），電鏡便成為診斷黃龍病的一個重要手段。在電鏡下，病原BLO的形態、大小及菌體的壁膜結構等特徵都能觀察得清楚，可以做出正確的診斷。但是，由於柑桔病樹體內BLO濃度較低，分布不均勻以及電鏡制樣採用的葉脈較小等因素的影響，電鏡對BLO的檢出率偏低，多在60～70％之間。近來，採用症狀明顯、老熟的葉片為材料，採用側脈代替中脈和縱切代替橫切韌皮部制樣，能夠有效地提高電鏡對BLO的檢出率。

3、血清學檢測
柑桔黃龍病病原屬於難培菌，僅限於感病柑桔韌皮部篩管細胞，含量低、分布不均勻，導致抗血清制備艱難。利用兔絲子成功地將黃龍病菌從柑桔轉到草本植物長春花上，黃龍病菌能夠得到比在柑桔樹體內更好的生長與繁殖，菌體濃度較高，為直接從長春花病株中提純黃龍病病原奠定了基礎（1986-通過、1987-回接）。從發病長春花粗提純黃龍病病原（柯穗帆野手 1988），以粗提純黃龍病病原為抗原制備了小鼠抗腹水，由於所提取病原的濃度和純度較低，該鼠抗腹水效價低，並伴有非特異反應，難以推廣應用（1989-提純）。隨後的研究表明，以類似方法制備的小鼠抗腹水盡管其效價有了較大提高，能夠比較准確的檢測發病長春花中的黃龍病病原，但是對未顯症或初顯症柑桔植株，以及部分具典型病狀的柑桔葉片的檢測並無血清學反應（1992 李德望）。有利用國外機構提供的多克隆抗體成功檢測柑桔黃龍病病原的報道（1993 張）。

國內對柑桔黃龍病單克隆抗體的研製並未獲得滿意的結果。福建省農業科學院果樹研究所柑桔黃龍病組，曾以柑桔黃龍病菌粗提純物為抗原，篩選到二個雜交瘤細胞株(CF1 和CF2)能分泌抗黃龍病病原的單克隆抗體。採用免疫熒光法檢測，抗體能識別長春花和柑桔病株，前者產生強熒光反應，後者產生弱熒光反應，而長春花和柑桔健株以及長春花感染MIO（植原體）的病株均不產生熒光反應（田1998）。柑態嫌桔黃龍病的單克隆抗體多僅適用於免疫熒光檢測，尚難用於酶聯免疫吸附測定法（ELISA），所以單抗的應用受到很大的限制。

4、組織化學診斷
主要基於兩個原理，一是感染黃龍病菌的寄主植物，其韌皮部壞死細胞群或經化學染色後的愈傷組織，在熒光的激發下會形成特殊的熒光而加以診斷。如以透射式熒光顯微鏡觀察，健葉和病葉葉柄切片在熒光的激發下，木質部導管胞壁發黃色熒光, 韌皮纖維發綠色熒光, 但感染黃龍病的病組織切片, 在韌皮部中則可看到1～多個鮮明的黃色或黃綠色熒光團塊（壞死細胞群），但取樣必須是完全老熟的黃化葉片, 而且以病秋梢的結果最穩定，嫩梢、嫩葉以及感染黃龍病但尚未表現症狀的葉片，因未產生壞死細無法檢測（1987-直接熒）；苯胺蘭作為熒光色素染色後，熒光顯微鏡下，病葉切片韌皮部愈傷組織會發出明亮的、不正常的黃綠色熒光，其強弱與症狀有關，斑駁葉熒光最強，其次為黃化後期缺素狀葉，健葉沒有或只有稀疏的幾點黃綠色熒光。其准確性同樣受取樣時間和取樣部位的影響，以夏梢和秋梢葉片轉綠而尚未充分老熟時取中脈切片染色觀察，准確性最高（1988-組織）。
二是韌皮部壞死細胞群或病原菌經化學染色後，能夠使壞死細胞群或病原菌與柑桔韌皮部篩管細胞分色，達到在光學顯微鏡下進行區分的診斷的目的。如番紅染色感染黃龍病的柑桔葉柄切片，顯微鏡下可觀察到韌皮部出現特有的紅色團塊，這種特徵性紅色團塊可以作為鑒定黃龍病的依據（1987-顯微鏡）；以FBA法浸染新梢主脈或嫩莖切片，能使病原體與柑桔韌皮部篩管細胞分色，光學顯微鏡下可觀察到病原的形態（1990 應用FBA）。顯微鏡觀察法方便直觀，但易受取樣部位、取樣時期和制樣方法(切片厚度等)的限制，容易造成漏檢，實際生產中少有採用。

5、生化指標診斷
用聚丙烯酞胺凝膠電泳法（PAGE）分析柑桔蛋白質種類上的差異，感染黃龍病的病株中，存在一種健株所沒有的特異性蛋白質，這種差異蛋白質與供試柑桔種類和症狀嚴重度無關，也不存在於類似黃龍病症狀的生理性病株中。因此，可憑借特異性蛋白的有無加以診斷。（1987-快速）。貢柑的黃龍病病株果實同工酶，缺少Rf=0.24的主酶帶，可能是貢柑感染黃龍病早期檢測的生化指標。(吉前華郭雁君梁廣堅姚金明，2007)。

6、 PCR檢測
（基因克隆與分析2002-琯溪/2000 DNA片段。1996-多聚、1998-診斷法。/PCR：1996-應用PCR、1998-Application、1999-Diagnosis、1999-快速、2003-沙田、2004-16S rDNA、PCR-SSCP、2005-廣佛手、2006-優化、2006-采樣、2007-不同引物、2007-野生、2007-孟祥春、2007-微芽、）
7、我們農民朋友最直接了當的檢測方法就是看到根不爛了、葉不黃了、果實可以成熟有經濟價值了，就叫治好黃龍病。

❷ 什麼是PCR技術

PCR技術是模擬體內DNA的天然復制過程，在體外擴增DNA分子的一種分子生物學技術，主要用於擴增位於兩段已知序列之間的DNA區段。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環後，DNA擴增2ⁿ倍。

PCR的每個循環過程包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個不同的事件：（①變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃左右）雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火；使溶液溫度降至50~60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合。

3、延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3』方向復制出互補DNA。

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【技術原理】

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。

因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

【工作原理】

類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火（復性）--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至90~95℃一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至50~60℃，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在DNA聚合酶的作用下，於70~75℃，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」。

而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

【工作步驟】

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

❸ 什麼是PCR技術PCR的基本原理是什麼

PCR技術是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。

PCR技術的基本原理：類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

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PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

❹ 什麼是pcr技術典型的pcr技術分為幾個步驟

Pcr技術是指DNA的體外擴增技術，也叫DNA多聚酶鏈式反應，該技術分為變性、復性和子鏈延伸三個步驟，變性是高溫下DNA解開雙鏈，復性是DNA模板鏈與引物配時，子鏈延伸是按鹼基互補配對原則合成子鏈。

❺ 什麼是PCR主要的技術步驟是什麼

PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一灶蠢消方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段隱知兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物檔罩沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

❻ PCR技術是什麼

PCR技術的基本原理：

該技術是差衡鉛在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依靠於DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，藉助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。

在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

PCR技術的應用：

PCR技術攔爛首次臨床應用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血虛好的基因突變開始的。

PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。

PCR技術不但能有效的檢測基因的突變，而且能准確檢測癌基因的表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預後判斷。

❼ pcr是什麼意思 怎麼理解pcr是什麼意思

1、PCR是聚合酶鏈式（PolymeraseChainReaction）反應的簡稱，是一種將幾個或幾十個拷貝數DNA片段擴增至上百萬份拷貝的方法，這是迄今為止最為重要的技術之一。PCR技術的影響卜輪純不僅僅局限於生物科學領域，幾乎人人都可以感受到PCR所帶來的改變，在親子鑒定以及犯罪調查中PCR技術便有廣泛應用。

2、PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互桐纖補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復型咐制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

❽ 什麼是PCR技術

PCR技術也就是基因擴咐嫌增技術，它是通過基因擴增儀，在細胞外進行DNA復制，由1個DNA分子增加到2個，然後依次增加到4個，8個…，使分子數目呈幾何級數增加，以在短時間內獲得足夠的DNA，供研究用的一種技術。

PCR技術的出現，使生物學的研究一大突破。在PCR技術問世之前，人們無法查出愛滋病病毒感染者，因為這種病毒在感染者體內的含量很少，衡橘手且難於培養。在PCR技術問世之後，可將愛滋病病毒的核酸進行擴增從而查出受感染者，並可研究治療方法。

PCR技術已經在分子生物學中發揮了重要作用。可以預知，它在遺傳病診斷、治療，在動、植物育種，以及在司法破案等方面，將會發揮更大的作用伍清。