免疫標記技術如何標記hrp

A. 酶標簽去除，HRP（辣根過氧化物酶）標記抗體的原理及操作流程是什麼 具體怎麼弄

HRP標記抗體的方備乎法 酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可採用不同的方法。對於制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。 戊二醛二步法1. 原理 戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。2. 標記步驟 (1) 稱取HRP25mg溶於1.25％戊二醛溶液中，於室溫靜置過夜。 (2) 反應後的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鍾，收集棕色流出猜滾虧液。如體積大於5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。 (3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽穗神水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。 (5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。 (6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。 (7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，最後沉澱物溶於少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子後(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鍾去除沉澱，上清液即為酶結合物，分裝後，冰凍保存。…………………… ……………………………… 更多具體材料請參考： 酶標簽去除 http://proct.bio1000.com/100165/

B. HRP標記抗體或抗原，最常用的方法是（）。

【答案】：B
改良過碘酸鈉法是目前用於HRP標記抗體或抗原的最常用的方法。

C. 免疫酶標記抗原的抗體常用底物是什麼

酶標記抗嘩巧體與相應的抗原發生反應，這里說它相應的抗原也可以是另外抗原的抗體。因為本身抗體也可作為另一種抗體的抗原。比如說western
blot裡面的一抗，二抗
酶標記抗體是由相關的酶與抗體結合，此抗體是與相應的抗原結合，即與抗原發生抗原抗體反應。這里的酶是一種特別的酶。凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應亂渣鍵滿足下列要求：(1)來源方便，易於純化；(2)比活性高，性質穩定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(hrp)和鹼性磷酸酶(ap)，其次梁嫌還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
本人用得比較多的是辣根過氧化物酶(hrp)的酶標記抗體。

D. ELISA HRP標記技術原理及步驟是什麼

原理：利用抗原能吸附到固相載體表面的特性，使抗原抗體行團啟反應在固相載體表面進行的免疫酶技術，從而簡化了抗原抗體結合物檔如分離的手續。
基本步驟：1包被：既是把抗原或抗體吸附到固相或核反應板上；2抗原抗體反應；3酶促反應。

E. 免疫印記檢測法

檢查原理：將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離, 然後取固定化基質膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場凳搭力或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉移到印跡紙上, 並且固相化。最後應用免疫覆蓋液技術如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對抗原固定化基質膜進行檢測和分析。

免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Western blotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由於免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用於鑒定某種蛋白，並能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種緩粗仔蛋白的表達量差異。

優點
免疫印跡法是一項分析抗原、抗體的技術。它具有下列優點：
1、 濕的固定化基質膜柔韌, 易於操作；
2 、固定化的生物大分子可均一的與各種免疫探針接近, 不會象凝膠那樣受孔徑阻隔；
3、 免疫印跡分析只需少量試劑；
4、 孵育、洗滌的時間明顯減短；
5、可同時制擾汪作多個拷貝, 用於多種分析和鑒定；
6、結果以圖譜形式可長期保存；
7、 免疫探針可通過降低PH值等方法, 象抹去錄音磁帶一樣將探針抹掉, 再換用第二探針進行分析檢測。免疫印跡法的應用范圍及優點不僅局限於此, 它必將隨著這一方法的深入研究而不斷發展和完善。

F. 有關HRP標記問題

能顯色，說明你的HRP標記BSA成功了。用BSA封了的孔也顯色（理論上不顯判攜色），最大的可能是你的稀釋度不賣敗夠，ELISA靈敏度很高的，你如果標得好的話，應該是要稀釋一萬到十萬倍，這樣陰性值才會不高。
你用BSA封閉沒什麼意思，可以換一種，比如明膠，酪蛋白等。
將HRP標記BSA稀釋成一定的梯中沖顫度。

G. 骨組織免疫組化實驗步驟（HRP-DAB法）

1. 拷片
石蠟切片37℃烤箱過夜（前一天放入烤箱，也可不做該步）。
脫蠟前於60℃烤箱烘烤2h。

2. 脫蠟與水化
依次將切片放入二甲苯I、II各10min。
乙醇梯度（100%、95%、80%、70%）各5min。
水洗5min。
TBS 3min×3，之後濾紙擦乾組織周圍，頌段指甲油描邊。

3. 抗原修復（二選一）
3.1 透明改喚質酸酶+胃蛋白酶修復（推薦）
透明質酸酶 37℃ 30min，TBS 3min×3；
胃蛋白酶 37℃ 30min，TBS 3min×3。

3.2 胰酶修復
0.125%胰酶 37℃ 20min，室溫冷卻10min，TBS 3min×3。

4. 封閉
5%BSA封閉液 37℃ 30min， 甩干不洗。
5. 孵育一抗
TBS或PBS稀釋一抗。4℃濕盒過夜。

6. 孵育二抗
TBS 5min×5。
3%H ₂ O ₂ 滴加於切片上，室溫避光10min。
滴加聚合HRP標記二抗，37℃，30min。
TBS 5min×5。
7. DAB顯野殲譽色
依照DAB顯色試劑盒說明書配製DAB顯色液，

顯微鏡下觀察控制顯色時間，蒸餾水終止。

8. 復染
蘇木素復染（鏡下觀察控制）。
飽和磷酸一氫鈉溶液返藍。
9. 封片
脫水：70%、80%、95%、100%乙醇各3min。
透明：二甲苯I、II各5min。
中性樹膠封片（從一側封片，且封片時勿將二甲苯去除，片子放其中一個個封片）。

注意事項：

H. 免疫組化原理、流程及結果分析

免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然後用HRP等標記的二抗與一抗進行結合，最後通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在於查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現。

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態學改變；而後者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。
通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。

免疫組化和****HE****染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜鹼性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色，經過一系列復雜的生化反應後，DAB(二氨基聯苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話，信號不夠強。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1、 ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力特性，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物，最後DAB顯色。
復合物配製：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物襲森素-過氧化物酶復合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素，但有兩汪磨個生物素親和力極高的結合位點，可以與二抗上的生物素結合，敏感性高，復合物不需要使用前混合，更為簡便。
3、 PAP法
4、 直接法

樣本制備

免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1 、必須設陽性對照和陰性對照。
2 、 抗原表達必須在特定部位。
3 、 陰性結果不能視為抗原不表達。

免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表

從表可以看出只有6、7實驗結果有意義。1-5均因對照組的結果已否定Ab的特異性或IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗或換用Ab。

染色失敗的幾種情況及原因:
1、拍陵畝 所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內。
2、 所有切片均呈陽性反應。
3、 所有切片背景過深。
4、 陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。

所有切片呈陽性反應，其原因:
1、 切片在染色過程中抗體過濃，或乾片了。
2、 緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不徹底。
3、 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應時間過長。
4、 抗體溫育的時間過長。
5、 H ₂ O ₂ 濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。

所有切片背景過深，其原因:
1、 內源性過氧化酶沒有完全阻斷。
2、 切片或塗片過厚。
3、 漂洗不夠。
4、 底物呈色反應過久。
5、 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當。

注意事項：
1、 蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
2、 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩乾洗滌液，但又防止乾片。
3、 以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應經常配製新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時，切片放傾斜。
⑤抗體孵育後PBS沖洗不充分。
⑥製片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
4、 一抗的清洗:
1、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2、溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
3、沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去 結合的物質。
5、 PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
2、中性及弱礆性條件（PH7-8）有利 於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利 於分解。
6、 拍照：
1、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。

I. 請教關於HRP標記二抗的免疫組化方法

親，你這問題咋解決了？

J. 酶聯免疫法的酶標記法

酶與抗體交聯，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用於實驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μg HRP溶於0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06 mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鍾 ， 取出加入0.16mol/L的乙氏羨二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鍾後加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻並裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液於4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結合，然團核信後吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時塌輪，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鍾後離心，將所得沉澱物溶於少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，並對之透析過夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進行測定後，冷凍乾燥或低溫保存。