Ⅰ CRISPR、CRISPR screen以及與單細胞測序的結合
首先來介紹一些CRISPR，它首先在大腸桿菌中發現，全稱為：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats【成簇的有規律的間隔短迴文重復】
1、 repeat ：short DNA ，20-40bp，Palindromic迴文【DNA轉錄後，迴文結構會形成發卡結構】
2、 spacer DNA ：間隔序列，將repeat間隔開【 spacer DNA可以和病毒DNA 完美匹配 ，特別是噬菌體DNA】
3、 cas ：CRISPR-associated【與CRISPR相關的基因】
【 cas蛋白具有解旋酶活性，可以將DNA鏈解旋，同時具有核酸酶橋知活性，可以切割DNA鏈 】==>>因此，這敏蠢消是細菌的一個免疫系統，通過這種方法，細菌可以抵抗其敵人：噬菌體
因此： 只要知道目標DNA 的序列，把它做成guide RNA，融合到cas蛋白上，就可以特異性的把這段序列切掉。
接下來，學習一下CRISPR技術的一個應用——CRISPR基因篩選
利用功能缺失的策略進行的高通量遺傳檔燃篩選 ，是研究人員快速尋找調控特定表型的重要或關鍵基因的主要方法。CRISPR基因篩選，可以通過 CRISPR gRNAs 靶向不同細胞中成百上千各異的基因，然後通過實驗篩選編輯細胞，gRNA 可以幫助確定哪些基因對於生物學作用機制具有至關重要的作用。然而，這種篩選方法比較適用於回答與細胞生長能力直接相關的問題。
如果我們想研究基因調控和其它復雜的生物控制機制，就要明白多個基因是如何協同工作還有調控調節細胞狀態。這就需要針對每個CRISPR靶向基因，分別進行培養，編輯和分析細胞。
這時候可以採用 CRISPR + inDrop scRNA-seq
在此，引用一篇通俗易懂的文章，很贊！！！
參考：
https://www.bilibili.com/video/BV15x411Z7kf?p=2
https://www.jianshu.com/p/cd402fc588af
Ⅱ CRISPR/Cas9指南
成簇規律間隔的短迴文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，即 CRISPR ）II型系統是細菌免疫系統，現已被改造用於基因工程。在CRISPR/Cas9廣泛應用之前，像鋅指核酸酶（ZFNs）或轉錄激活因子類效應核酸酶（TALENs）等基因工程技術，都需要使用定製的DNA結合蛋白核酸酶，這需要科學家為每個基因靶標設計和生產新的核酸酶對(nuclease-pair)。（相比而言，）CRISPR主要因其簡單性和適應性，已迅速成為基因工程中最受歡迎的方法之一。
CRISPR包括兩個部分：一個向導RNA( gRNA )和一個非特異性CRISPR結合核酸內切酶(CRISPR-associated endonumclease即 Cas9 )。向導RNA是一個短的合成RNA,由一段結合Cas9必需的scaffold序列和特定的約20nt的空載(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位點）組成，其中靶向序列決定了用於修飾的基因靶標。因此我們只需改變gRNA上的靶向序列即可改變Cas9的基因靶標。CRISPR最初用於敲除各種細胞類型或生物體的靶向基因，但對Cas9酶的改造已經將CRISPR的應用擴展到選擇性激活或抑制靶向基因或純化特定的DNA區域，甚至可以和熒光顯微結合用於展現活細胞中的DNA。而且，產生gRNAs的便捷促使CRISPR成為了最具擴展性的基因編輯技術之一，近來已被應用於基因組水平的篩查。
這篇指南將提供CRISPR/Cas9生物學方面的概覽，介紹CRISPR的不同應用，幫助諸位在各自領域上開展CRISPR/Cas9的研究。
通過靶向基因特異的gRNA和核酸內切酶Cas9的共表達，CRSIPR/Cas9可用於產生敲除細胞或敲除動物。** 基因靶位點可以是任何滿足以下兩點條件的約20nt的DNA序列握皮：**
PAM序列是結合靶標必不可少的，具體序列取決於Cas9的種類（釀膿鏈球菌Cas9 5』NGG3』）。我們將關注釀膿鏈球菌Cas9，因其目前廣泛使用於基因工程。一旦表達，Cas9蛋輪雹白和gRNA將形成一個核糖體蛋白復合物，這個復合物是通過gRNA的scaffold區域和Cas9上表面暴露帶正電荷的溝糟相互作用形成的。Cas9與gRNA的結合後構象發生了改變，分子由無活性的非DNA結合構象轉變為有活性的DNA結合構象。更重要的是gRNA上的靶位點序列仍未和靶標DNA發生相互作用。Cas9-gRNA復合體將任意地結合基因組上的PAM序列，但是只有gRNA靶位點序列與靶標DNA配對時，Cas9才能進行切割（這段靶標DNA）。一旦Cas9-gRNA復合物結合到一段認定的DNA靶標，在gRNA靶向序列3』端的「種子」序列開始使靶標DNA退火。如果種子序列與靶標DNA序列配對，gRNA將持續的沿3』到5』端方向使靶標DNA退火。
只有當gRNA靶位點序列與靶基因有足夠的同源性存在時，Cas9才會作用切割靶基因。拉鏈式的退火機制可能解釋了為什麼靶標上3』端種子序列上的錯配會完全破壞對靶標的切割，而5』端的錯配有可能會對靶標進行切割。Cas9核酸酶有兩個功能性內切酶區：RuvC和HNH。當Cas9與靶基因臘皮帆位點結合時發生了第二次構象變化，核酸酶功能區對靶標DNA的反向鏈進行定位切割。Cas9介導的DNA切割最後結果是目標DNA（PAM序列上游約3～4nt）的雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。
雙鏈斷裂後由以下兩種常規的修復途徑進行修復：
NHEJ修復途徑是最活躍的修復機制，能快速的修復雙鏈斷裂，但通常會在雙鏈斷裂位點產生小的插入缺失。NHEJ介導的雙鏈斷裂修復的隨機性具有重要的實用意義，因為Cas9和gRNA在細胞群體中的表達，將產生多種不同的突變。大多數情況下，NHEJ引起的靶標DNA上的小InDels，會導致閱讀框內的氨基酸插入缺失，或者移碼突變引起的目標基因上ORF提前終止。理想情況下，在靶標基因內形成功能缺失性的突變。然而，對特定的突變細胞表型的敲除能力最終取決於殘存的基因功能的劑量。
當gRNAs設計准確時，CRISPR/Cas9具有很高的特異性，但是特異性依然是一個主要的關注點，特別是當CRISPR應用於臨床時。CRISPR系統的特異性主要取決於gRNA靶向序列特異性如何，即基因靶標相比於基因組其餘部分的情況。理想狀態下，gRNA靶向序列與靶標DNA具有高度同源，而與基因組上其它位置沒有同源性。（但）現實是，在基因組上，會有另外的位點與指定的gRNA靶向序列部分同源。這些位點被稱為「脫靶」，你在設計gRNA時需要考慮到這些位點。
為了優化gRNA的設計，CRISPR的特異性可以通過改造Cas9自身來得到提升。如先前討論那樣，Cas9通過兩個核酸酶功能區域，RuvC和HNH，的結合活性來形成雙鏈斷裂。每個核酸酶結構域上精確的氨基酸殘基是已知的，這些殘基序列對內切酶的活性至關重要（在釀膿鏈球菌Cas9中D10A對HNH和H840A對RuvC），Cas9酶的修正版已生成，它僅包含一個催化活性功能域(稱為「Cas9 nickase」)。Cas9切口酶依然基於gRNA的特異性來結合DNA,但切口酶僅能切開DNA的一條鏈，形成一個切口「nick」,或使單鏈斷開，而不是雙鏈斷裂。使用完好的互補鏈作為模板，DNA上的切口迅速地被HDR途徑（同源性修復途徑）修復。因此需要使用兩個切口酶來切割靶標DNA的兩條鏈以形成雙鏈斷裂（這種通常被稱為「double nick」或者「al nickase」CRISPR系統）。這種需求迅猛地增加了靶特異性，因為這和在足夠近的范圍內雙鏈斷裂產生的兩個脫靶的nicks的方式截然不同。因此，如果特異性或者減少脫靶的影響是考慮的關鍵因素，那麼就採用雙切口酶方法來產生兩個nick引起的雙鏈斷裂。為了獲得高特異性的基因編輯，切口酶系統也可以聯合HDR（同源性修復途徑）介導的基因編輯一起使用。
NHEJ介導的雙鏈斷裂修復不夠完美，通常會導致基因ORF閱讀框的中斷，HDR能用於產生特異性的核苷酸改變（這也是人們所說的基因「編輯」），這種改變小到單核苷酸改變大到大片段插入（例如，添加一個熒光基團或者tag）。
為了利用HDR進行基因編輯，一段DNA」修復模板」序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同轉入研究者感興趣的細胞中。修復模板必須包含所需編輯位點以及緊鄰靶標的上下游同源序列（稱作左右同源臂）。每條同源臂的長度以及結合位點取決於想要進行的改變的大小。修復模板可以是一個單鏈寡核苷酸/雙鏈寡核苷酸/雙鏈DNA質粒，這因不同的應用而不同。值得一提的是，修復模板在基因組DNA不能帶有PAM序列，否則修復模板將成為Cas9切割的合適目標。例如，PAM序列可以進行突變處理，以至於不再出現，但是基因編碼區不受影響（也即，沉默突變）
即使在表達Cas9、gRNA和外源性修復模板的細胞中，HDR效率通常也比較低（低於修飾等位基因的10%）。因此，一些實驗室人為地嘗試加強HDR，有的是在HDR起作用時同步化細胞周期，有的是通過化學的或遺傳學的抑制基因來參與NHEJ。HDR的低效性有許多重要的實用意義。首先，因為Cas9的切割效率相對較高，而HDR效率相對較低，一部分Cas9引導的雙鏈斷裂被NHEJ修復。也就是說，最後細胞群體中會包含一些野生型等位基因，NHEJ修復的等位基因，和/或一些所需的HDR編輯等位基因。因此，需要通過實驗來驗證所需的編輯是否存在，如必要的話，對所需編輯的克隆進行分離。
Ⅲ CRISPR-Cas9基因編輯技術簡介
CRISPR-Cas9是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出後的第三代基因編輯技術，短短幾年內,CRISPR-Cas9技術風族歷靡全球, 成為現有基因編輯和基因修飾裡面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術之一，成為當今最主流的基因編輯系統。
一、什麼是CRISPR-Cas系統
CRISPR-Cas系統是原核生物的一種天然免疫系統 。某些細菌在遭到病毒入侵後，能夠把病毒族穗扒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。
C RISPR-Cas系統包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關聯基因）兩部分。
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1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因組內的一段重復序列 。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的規律性間隔的短迴文重復序列）。分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古細菌當中。 （註：生活在深海的火山口、陸地的熱泉以及鹽鹼湖等極端環境中，有一些獨特結構的細菌，稱為古細菌）
CRISPR基因序列主要由前導序列（leader）、重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）構成 。
①前導序列 ：富含AT鹼基，位於CRISPR基因上游， 被認為是CRISPR序列的啟動子 。
②重復序列 ：長度約20–50 bp鹼基且包含5–7 bp迴文序列，轉錄產物可以形成發卡結構， 穩定RNA的整體二級結構 。
③間隔序列 ： 是被細菌俘獲的外源DNA序列 。這就相當於細菌免疫兆昌系統的「黑名單」，當這些外源遺傳物質再次入侵時，CRISPR/Cas系統就會予以精確打擊。
2、Cas基因位於CRISPR基因附近或分散於基因組其他地方，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（ CRISPR associated，Cas ）。
Cas基因編碼的Cas蛋白在防禦過程中至關重要，目前已經發現了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。
依據Cas蛋白在細菌免疫防禦過程中參與的角色，目前將CRISPR-Cas系統分為兩大類。
第一大類 ：它們切割外源核酸的效應因子為多個Cas蛋白形成的復合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。
第二大類 ：它們的作用因子是比較單一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。
目前，被最為廣泛應用的CRISPR系統是II型CRISPR-Cas系統，也就是CRISPR-Cas9系統。
二、CRISPR-Cas9的作用原理
對於CRISPR-Cas9的作用機理可以分為三個階段來理解。
1、第一階段：CRISPR 的高度可變的間隔區的獲得 （ 俘獲外源DNA，登記「黑名單」 ）
CRISPR 的高度可變的間隔區獲得，其實就是指外來入侵的噬菌體或是質粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因組，整合的位置位於CRRSPR 的5' 端的兩個重復序列之間。因此，CRISPR 基因座中的間隔序列從5' 到3' 的排列也記錄了外源遺傳物質入侵的時間順序。
新間隔序列的獲得可能分為三步：
第1步：Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描入侵的DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原型間隔序列。
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第2步：Cas1/2蛋白復合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。
第3步：DNA會進行修復，將打開的雙鏈缺口閉合。這樣一來，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。
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2、第二階段：CRIPSR 基因座的表達（包括轉錄和轉錄後的成熟加工）
CRISPR序列在前導區的調控下轉錄產生pre-crRNA（ crRNA的前體 ），同時與pre-crRNA序列互補的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被轉錄出來。pre-crRNA通過鹼基互補配對與tracrRNA形成雙鏈RNA並與Cas9編碼的蛋白組裝成一個復合體。它將根據入侵者的類型，選取對應的「身份證號碼」（ 間隔序列RNA ），並在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的協助下對這段「身份證」進行剪切，最終形成一段短小的crRNA（ 包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復序列區 ）。
crRNA，Cas9以及tracrRNA組成最終的復合物，為下一步剪切做好准備。
3、第三階段：CRISPR/Cas 系統活性的發揮（靶向干擾）
crRNA，Cas9以及tracrRNA組成最終的復合物就像是一枚制導導彈，可以對入侵者的DNA進行精確的打擊。這個復合物將掃描整個外源DNA序列，並識別出與crRNA互補的原間隔序列。這時，復合物將定位到PAM/原間隔序列的區域，DNA雙鏈將被解開，形成R-Loop。crRNA將與互補鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態。
隨後，Cas9蛋白精確的平端切割位點位於PAM上游3個核苷酸位置，形成平末端產物。Cas9蛋白的HNH結構域負責切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結構域負責切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA的表達被沉默，入侵者被一舉殲滅。
三、 CRISPR-Cas9基因編輯技術及應用…
tracrRNA-crRNA在被融合為單鏈向導RNA（sgRNA）時也可以發揮指導Cas9的作用。
CRISPR-Cas9基因編輯技術就是通過人工設計的 sgRNA（guide RNA）來識別目的基因組序列，並引導 Cas9 蛋白酶進行有效切割 DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷後修復會造成基因敲除或敲入等，最終達到對基因組DNA 進行修飾的目的。
CRISPR-Cas9的廣泛應用
1、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細胞會採用高效的 非同源末端連接 方式（NHEJ）對斷裂的DNA進行修復。但是，在修復過程中通常會發生鹼基插入或缺失的錯配現象，造成移碼突變，（ 移碼突變 ：是指DNA分子由於某位點鹼基的缺失或插入，引起閱讀框架變化，造成下游的一系列密碼改變，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標基因失去功能，從而實現基因敲除。為了提高CRISPR系統的特異性，可將Cas9的一個結構域進行突變，形成只能對DNA單鏈進行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設計兩條sgRNA序列，分別靶向DNA互補的兩條鏈，這樣兩條sgRNA特異性的結合靶標序列，即可形成DNA斷裂，並在修復過程中通過移碼突變實現基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
當DNA雙鏈斷裂後，如果有DNA修復模板進入到細胞中，基因組斷裂部分會依據修復模板進行 同源重組修復 （HDR），從而實現基因敲入。修復模板由需要導入的目標基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈，也可以是雙鏈DNA質粒。HDR修復模式在細胞中發生率較低，通常小於10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學家致力於提高HDR效率，將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期，促進修復方式以HDR進行；或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ，提高HDR的效率
3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特點是能夠自主結合和切割目的基因，通過點突變的方式使Cas9的兩個結構域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9隻能在sgRNA的介導下結合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結合到基因的轉錄起始位點，可以阻斷轉錄的開始，從而抑制基因表達；將dCas9結合到基因的啟動子區域也可以結合轉錄抑制/活化物，使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在於，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，並不會對基因組DNA造成永久性的改變。
4、多重編輯（Multiplex Editing）
將多個sgRNA質粒轉入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的准確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質粒上可以構建2～7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。
5、功能基因組篩選
利用CRISPR-Cas9進行基因編輯可以產生大量的基因突變細胞，因此利用這些突變細胞可以確認表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導致的。基因組篩選的傳統方法是shRNA技術，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結果。CRISRP-Cas9系統的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優勢，在基因組篩選中得到了廣泛的應用。目前CRISPR的基因組篩選功能應用於篩選對表型有調節作用的相關基因，如對化療葯物或者毒素產生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。
CRISPR-Cas9基因編輯技術簡介 - 知乎 (hu.com)
Ⅳ 精準大海撈針--CRISPR screening專題
由於Addgene的篇幅太長，因此決定分為至少兩個部分來介紹。
上期： 來自Addgene的CRISPR指南（1）
參考： CRISPR Guide
由於這個部分已經不是簡單的看CRISPR guide了，中間還有查閱資料，文獻閱讀的工作，因此沒有再冠以CRISPR Guide的名字。
某天晚上我和師妹在微信上描述CRISPR screening實驗時，她表示驚嘆說，師姐這難道不是精準的大大念悄海撈針嗎？因此本期我們的文章標題使用了師妹非常精闢的描述。在平時，我們要研究某基因的功能只能通過單獨敲低/敲除、過表達的方式，而CRISPR screening允許我們同時進行上萬個這樣的操作，一次搞定基因組范圍的基因編輯，確可謂：精準大海撈針。
高通量是新時代生物技術的標配，從能一次完成超過5萬個基因的PCR（RNA-seq）到細胞譜系追蹤（barcoding），在不影響研究精準度的情況下，大大的降低科滾渣學研究時間和成本。依據我們前面的介紹，sgRNA將Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9結合到DNA上後剪切DNA，那麼以下這幾種情況則非常好理解：
（1）Cas9 + 1個sgRNA：針對一個基因進行編輯；
（2）Cas9 + 2個sgRNA：可針對兩個基因進行編輯，或者可敲除兩個sgRNA之間的大DNA片段；
（3）Cas9 + 多個sgRNA：可同時對多個基因進行編輯；
（4）Cas9 + 上萬個sgRNA：同時對上萬個基因進行編輯。
針對第3、4種情況，這多高辯個sgRNA的合集被稱為CRISPR文庫（CRISPR Library），文庫的大小可從幾十個sgRNA到十幾萬個sgRNA。文庫的出現使得我們可以 同時對上萬個基因進行編輯，再篩選出對某特定表型有明顯作用的基因集，用於指導下一步研究 ，這一過程稱為 CRISPR screening ，舉例如下圖：
從上圖中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），並通過慢病毒轉導的方式轉入Cas9穩定表達或野生型細胞（D），pool sgRNA感染的細胞經過特定特徵（耐葯性等）區分後，通過NGS測序鑒定與特定特徵相關的基因集。除了常規流程的展現，我們還需要注意到 構建pool library的工作量是相當大的 ，如張峰教授組的GeCKO v2 Library可針對19,050個編碼基因，而為了提高編輯效率，每個基因都設計了至少6個sgRNA，因此整個library包含有123,411個sgRNA，每個sgRNA都要構建出相應質粒，整個library的構建花費不菲，而我們只需要用500美元即可從Addgene上購得，能夠使用這樣的工具，真得感謝這些巨人們。
CRISPR Library的類型也根據實驗目的、物種、文庫大小和投遞方式分類，具體信息可以在Addgene網頁上可以查看：
在設計CRISPR screening實驗之前需要思考以下問題：
（1）CRISPR screening在准備階段需要使用電轉的方式擴增文庫，並需要NGS測序來確定文庫豐度，盡管目前已經有一些library可以選用化學感受態細胞進行擴增，但選用library之前一定要查閱清楚；
（2）CRISPR screening實驗需要大量的細胞，因此對於一些無法擴增、數量有限且非常珍貴的細胞時，如原代細胞等，CRISPR screening則可能不適用；
（3）大多數CRISPR文庫需要使用慢病毒將gRNA/Cas9傳遞到目標細胞。
因此，使用者需要充分考慮課題組的條件是否能達到以上要求。一旦確定實驗條件適合，那麼下一步就是選擇library， 在選擇文庫時，也需要考慮以下幾點 ：
（1）基因修飾的類型：敲除、激活還是抑制目標基因；
（2）gRNAs的數量：CRISPR Library可以針對整個基因組或某一類特定的基因，例如最近報道的用於增強CRT T細胞在實體瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36個目的基因。
（3）物種：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs對於特定生物體的基因組是唯一的，並且文庫只與來自該生物體的細胞兼容。
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9，則直接使用即可；如骨架中無，需要搭配使用Cas9質粒或者要求細胞本身就表達Cas9。
大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投遞系統， 一般有這幾種骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下圖） 等，區別在於前者的骨架中已帶有Cas9，因此是一個質粒系統；而後者需要疊加使用一個Cas9質粒。
每個CRISPR文庫都是不同的，然而大多數CRISPR文庫有幾個共同的特性：首先，每個基因文庫通常包含3-6個gRNAs，以確保每個靶基因的編輯效果，因此CRISPR文庫包含數千個針對多種基因的獨特gRNAs；CRISPR文庫的gRNA設計通常是優化選擇high on-target和low off-target的gRNA；敲除文庫通常針對5' 組成性表達的外顯子，而激活和抑制文庫則針對啟動子或增強子區域。
雖然含有Cas9的慢病毒文庫是目前最流行的CRISPR篩選方法，但它們並不適用於所有的細胞類型或實驗。AAV骨架的哺乳動物CRISPR文庫主要用於體內實驗，逆轉錄病毒形式的文庫可用於慢病毒轉導效率差的細胞中。此外，由於技術問題，CRISPR在細菌中的應用較少，但仍有幾個細菌CRISPR文庫通過dCas9作用達到抑制效果。
在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，作者為探討調控HIV病毒潛伏的關鍵基因，作者首先構建HIV的熒光報告細胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），當HIV病毒復制的時候，GFP也同時表達，因此可以通過綠色熒光來觀測HIV病毒的活動情況。
在HIV-GFP報告細胞中，轉入sgRNA library進行大規模基因敲除，一定時間後用FACS分選出強綠色熒光表達細胞，經過4個循環後則得到了低熒光（HIV潛伏）和高熒光（HIV活動）兩組細胞，通過NGS測序發現兩組細胞中的sgRNA豐度情況，經過3次重復後得到257個基因對HIV病毒活動有正向作用，最後通過數據分析篩選出TOP的gene集。後續可針對TOP基因集進行針對性的驗證。
通過這個例子，我們還可以想像，把GFP細胞換成腫瘤葯耐葯細胞如厄洛替尼，將FACS分選換成給葯+不給葯兩組，一定時間後檢測兩組細胞的sgRNA豐度差別，則可以找到厄洛替尼耐葯相關的基因。
（1）需要注意骨架中的啟動子是否適合自己的目的細胞，例如CMV啟動子非常廣譜，但對於人胚胎幹細胞的效率則非常低，需要選用帶有EF1α啟動子的骨架。
（2）部分library要求細胞本身就表達Cas9，這本無可厚非，但部分細胞在高表達Cas9的情況下非常脆弱，這時候需要考慮使用incible Cas9 system，而這個系統的構建本身就是有難度的實驗，因此在設計可提前一定要做好全面分析。
（3）Library擴增工作量非常大，需要盡可能的嚴格按照protocol進行，並且配備質粒超大提試劑盒，部分Library要求使用特殊的感受態細胞，而該細胞之外國外出售並且非常貴。
（4）由於Library非常龐大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的轉染試劑則花費非常大，此時可以考慮使用PEI40000等便宜且效果又好的轉染試劑。
（5）此外，慢病毒的包被需要選擇狀態好且代數低的293T細胞，如果有293FT細胞則效果更佳。
（6）考慮篩選標記的沖突，例如目的細胞是通過慢病毒轉染的方法穩定表達Cas9，且篩選標記是puromycin，那麼幾乎所有的Library的抗性篩選基因都是puromycin，這就沖突了。
具體更多的細節還需要我們去發現。
Ⅳ NEPA21-讓Crispr-Cas9基因編輯技術與類器官培養研究如虎添翼的利器
類器官
類器官（Organoids），是指利用成體幹細胞（ESCs）或誘導式多能幹細胞（iPSCs）進行體外三維（3D）培育的具有一定空間結構的組織類似物。類器官能高度模擬體內組織結構及功能並能夠長期穩定傳代培養。類器官模型是介於細胞系和動物模型之間的一種新型功能化體外模型，可用於解析遺傳發育、建立疾病模型、篩選葯物和檢測毒性以及探索個性化醫療方案。迄今為止世界各國科學家陸續培養出腦、肝、胃、肺、腸、腎臟和胰腺等各種類器官。
2013年，類器官技術被《Science》評為十大科技突破之一，2017年，又被《Nature Methods》評為生命科學領域的年度技術（Method of the Year 2017）。
荷蘭科學家Hans Clevers教授是類器官世枝研究領域國際公認的先驅和鼻祖，早在2009年，Hans Clevers就發現Lgr5蛋白是腸道幹細胞的標志物，並成功建立了首個腸道幹細胞體外3D類器官培養體系，開創了類器官作為疾病模型的研究時代。
目前，類虛返消器官在生命科學研究中應用廣泛，通過改變不同類器官的基因可以極大地幫助研究生物學過程和疾病建模。然而，由於缺乏簡單的基因組工程方法，基因組編輯人類類器官的構建比較困難。
CRISPR/Cas9是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。在向導RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA可被看作病毒或外源DNA，得到精確編輯。
在2020年3月份，HansClevers研究團隊在《Nature Cell Biology》雜志上發表學術論文《Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing》。
其利用非同源依賴的CRISPR-Cas9技術，可快速高效地對人源類器官進行基因敲入，他們將該技術命名為CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，為人源類器官的內源基因敲入提供了重要的工具平台。
研究人員利用這種新方法分析了肝細胞如何分裂以及DNA過多異常肝細胞是如何出現的，並發現敲除癌症基因TP53，異常肝細胞的非結構化分裂會更頻繁。以上發現或有助於深入研究相關癌症的發展過程。
研究者們為了印證CRISPR–HOT技術在人源類器官中進行基因敲入的方法可行，首先在兩種難以轉染的人源類器官（肝臟導管類器官及肝細胞類器官）進行測試，並對兩種不同介導方式的基因敲入技術產生的類器官進行對比分析。
圖示： HDR與NHEJ的技術路線以及優劣比較
結果發現，雖然抑制TP53的活性之後，HDR介導的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介導的基因編輯效率要低。Hans Clevers研究組的工作用CRISPR-HOT方法，建立了不依賴於對TP53活性抑制的以NHEJ介導的基因編輯技術，簡化了基因敲入的流程，對於肝細胞等成體幹細胞來源的類器官可視化研究提供了可靠的基因編輯方式。
2020年11月，Hans Clevers研究團隊又在《Nature Protocols》雜志發表學術論文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》，闡述利用CRISPR/Cas9基因編輯技術探究人類胎兒肝細胞作為類器官長期擴增的培養條件。
在文章中，作者提出：針對人類胎兒肝細胞和人類肝導管類器官的基因組編輯需要兩種不同的實驗程序。對於人類胎兒肝細胞類器官，採用基於電轉杯電轉染的轉染策略。為此，類器官必須分解成單細胞或小塊細胞，建議從第5代及以後開始對肝細胞類器官進行基因組工程設計，肝細胞類器官電穿孔的能力通常不會隨時間而降低，作者已經成功地對人胎兒肝細胞類器官進行了基因組工程，差知可以做到至少第50代為止。
圖示：人類胎兒肝細胞類器官的基因組 工程技術概略圖
(採用電轉杯電轉染)
相反，對於人肝導管類器官，轉染步驟是對完整的類器官進行的，是一種離體組織電轉染的方式。
圖示：人類肝臟導管類器官的基因組工程技術概略圖
(採用離體組織電轉染)
另外針對不同的基因編輯方式（Knock in和Knock out），作者也分享了非常詳細的應對策略（見下圖）。
俗話說，工欲善其事，必先利其器。那麼在Hans Clevers研究團隊深耕的類器官領域中，屬於他們的一把利器是什麼呢？我們發現，在大牛們的研究過程當中，對細胞的轉染操作貫穿其中。而NEPA GENE的 NEPA21基因高效轉染系統 正是他們所選用的高效電轉儀。
NEPA21 基本介紹
【1】採用全新設計的電轉程序，電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因導入+反向導入模式。
【2】不需要特殊轉染試劑輔助，節省實驗成本；電轉程序中的各項參數實時可見、可調，特別適用於優化原代細胞、非常見細胞的電轉參數。
NEPA21高效基因轉染系統獨有的電壓衰減（Voltage Decay）設計，可在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。專門針對難轉染的原代免疫細胞、幹細胞、神經細胞、活體動物、受精卵以及宮內胚胎等轉染。
得益於NEPA21良好的應用體驗，Hans Clevers利用其已在類器官領域取得了豐碩的研究成果。目前已有多篇應用文獻，是Crispr/Cas9基因編輯的第一品牌電轉系統。NEPE21——讓細胞轉染更簡單、更Free。
Ⅵ CRISPR/Cas9 設計sgRNA
CRISPR/Cas9 系統作為細菌和古細菌的獲得性免疫系統， 通過 RNA 介導特異性的切割外源遺傳物質， 用以對抗入侵的病毒和質粒。利用 Cas9 來摧毀入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 系統， 可以在體外進行基因的編輯。
為了提高CRISPR/Cas9 的特異性，使用 Cas9 切口酶和一對 sgRNA，兩個相近的切口造成 DNA 雙鏈斷裂， 誘導細胞發山旅生非同源末端連接修復， 造成目的基因的突變。
利用 CRISPR/Cas9 進行基因的編輯，首先要構建有效的 sgRNA。一般地，基因特異的 sgRNA 模板序列為位於 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前間區序列鄰近基序。這是一種見於 crRNA 分子的短核苷酸基序，可以被 Cas9 蛋白特異性識別並切割的 20 個 nt。 而 PAM 序列的特徵為 NGG（其中 N 為任意核苷酸）
01
****找敲除目的基因的外顯子****
根據目的基因選擇待敲除靶基因位點找出敲除目的基因的外顯子。 首先在第一個起始密碼子 ATG 之後的外顯子中找出特異性高的上下游序列。以小鼠基因 Th 為例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 區，選擇第二個外顯子作為敲除位點。
02
****設計成對 sgRNA 序列****
打開網站 http://crispr.mit.e ，將基因名稱，郵箱，第二外顯子序列輸入到對話框，點擊 Agree and submit，等待網站設計成對的 sgRNA 序列。一般推薦網站設計，因為網站可老槐以預測脫靶位點數，避免基因脫靶產生。當然也可以手動選擇特異的 sgRNA 序列。
設計成對的 sgRNA 序列。打開 Nickase analysis，如圖所示，網站會給出多組成對 sgRNA 序列，如箭頭所示，並且預測可能脫靶數。
03
****分析逗含凳成對 sgRNA 序列****
打開 http://www.oligoevaluator.com ，將 sgRNA 輸入，點擊 Calcute，得到基因分析。綜合考慮 Tm（56~62）、GC content （45～60%） 及 secondary structure 來最終確定適宜的 sgRNA 序列，因此，高 score 的序列不一定是最佳序列。
如圖，第一對 81 分的序列，Tm 值大於 62 度，而且存在穩定二級結構，所以並不推薦。所以應該從上述成對序列中繼續尋找合適成對 sgRNA 序列。
04
****根據找到的合適的 sgRNA 訂購 oligo****
圖為 U6 真核表達載體設計，Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。
05
****關於 cas9 的幾個注意事項****
Ⅶ 什麼是CRISPR
CRISPR技術是一種簡單而強大的基因組編輯工具。它使研究人員能夠很容易地改變DNA序列和修改基因功能。它的許多潛在應用包括糾正遺傳缺陷、治療和防止疾病傳播以及改良作物。然而，它的承諾也引起了倫理問題。
在流行用法中，「CRISPR」（發音為「crisper」）是「CRISPR-Cas9」的縮寫。CRISPRs是DNA的特殊延伸。蛋白質Cas9（或「CRISPR相關」）是一種類似於一對分子剪刀的酶，能夠切割DNA鏈。
CRISPR技術是根據細菌和古細菌（單細胞微生物領域）的自然防禦機制改編而成的。這些生物體利用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白（包括Cas9）來抵禦病毒和其他異物的攻擊。他們這樣做主要是通過切割和破壞外國侵略者的DNA。當這些成分被轉移到其他更復雜的有機體中時，它允許對基因進行操作或「編輯」。
直到2017年，沒有人真正知道這個過程是什麼樣子的。在2017年11月10日發表在《自然通訊》雜志上的一篇論文中，由金澤大學的Shibata Mikihiro和東京大學的Hiroshi Nishimasu領導的一個研究小組展示了CRISPR第一次運行時的樣子。[一個驚人的新GIF顯示CRISPR咀嚼DNA]
CRISPR-Cas9：關鍵玩家CRISPRs：「CRISPR」代表「有規律間隔的短迴文重復序列簇」。它是DNA的一個特殊區域，具有兩個明顯的特徵：核苷酸重復序列和間隔序列的存在。核苷酸的重復序列——DNA的組成部分——分布在CRISPR區域。間隔序列是散布在這些重復序列中的DNA片段。
對於細菌來說，間隔序列是從先前攻擊有機體的病毒中提取的。它們作為一個記憶庫，使細菌能夠識別病毒並抵禦未來的攻擊。
這是由食品配料公司Danisco的Rodolphe Barrangou和一組研究人員首次通過實驗證明的。在2007年發表在《科學》雜志上的一篇論文中，研究人員以酸奶和其他乳製品培養物中常見的嗜熱鏈球菌為模型。他們觀察到，病毒攻擊後，新的間隔蛋白被整合到CRISPR區域。此外，這些間隔區的DNA序列與病毒基因組的部分序列相同。他們還通過取出或核腔派放入新的病毒DNA序列來操縱間隔區。通過這種方式，他們能夠改變細菌對特定病毒攻擊的抵抗力。因此，研究人員證實了CRISPR在調節細菌免疫中的作用。
CRISPR RNA（crRNA）：一旦一個間隔基被結合並且病毒再次攻擊，CRISPR的一部分被轉錄並加工成crisprrna或「crRNA」。CRISPR的核苷酸序列作為模板產生互補的單鏈RNA序列。根據Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2014年發表在《科學》雜志上的一篇評論，每個crRNA由一個核苷酸重復序列和一個間隔部分組成。
Cas9：Cas9蛋白是一種切割外來DNA的酶。
該蛋白通常與兩個RNA分子結合：crRNA和另一個稱為tracrRNA（或「反式激活crRNA」）。兩人隨後將Cas9引導至目標地點，在那裡進行切割。這片DNA是對crRNA的20個核苷酸延伸的補充。
使用兩個獨立的區域，或其結構上的「域」，Cas9切割DNA雙螺旋的兩條鏈，使所謂的「雙鏈斷裂」，根據2014年的科學文章。
有一個內置的安全機制，它確保Cas9不會在基因組中的任何地方被切斷。已知短DNA序列s-PAMs（「鄰近原間隔基序」）作為標記，與目標DNA序列相鄰。如果Cas9復合物的目標DNA序列旁邊沒有PAM，它就不會被切割。根據《自然生物技術》（Nature Biotechnology）2014年發表的一篇評論圓握，這可能是Cas9從未攻擊細菌CRISPR區的一個原因。
CRISPR-Cas9作為基因組編輯工具不同生物體的基因組在其DNA序列中編碼一系列信息和指令。基因組編輯包括改變這些序列，從而改變信息。這可以通過在改賀DNA中插入一個切口或一個斷裂，並誘騙細胞的自然DNA修復機制來引入人們想要的改變來實現。CRISPR-Cas9提供了一種方法。
在2012年，兩篇關鍵的研究論文發表在《科學》和《國家科學院學報》上，這兩篇論文幫助細菌CRISPR-Cas9轉化為一個簡單的、可編程的基因組編輯工具。
這項研究由不同的小組進行，結論：Cas9可以直接切割DNA的任何區域。這可以通過簡單地改變crRNA的核苷酸序列來實現，crRNA與互補的DNA靶點結合。在2012年的《科學》文章中，Martin Jinek和他的同事們進一步簡化了這個系統，將crRNA和tracrRNA融合在一起形成一個單一的「導向RNA」。因此，基因組編輯只需要兩個組成部分：導向RNA和Cas9蛋白。
，哈佛醫學院遺傳學教授喬治·丘奇說：「你設計了一段20個核苷酸鹼基對，它們與你想要編輯的基因相匹配。」。構建了與這20對鹼基互補的RNA分子。丘奇強調了確保核苷酸序列只在目標基因中發現，而在基因組中沒有其他發現的重要性。」然後，RNA加上蛋白質[Cas9]會像剪刀一樣在那個位置切割DNA，理想情況下是在別的地方，「他解釋道，」一旦DNA被切割，細胞的自然修復機制就會啟動，並將突變或其他變化引入基因組。這有兩種可能發生的方式。根據斯坦福大學的亨廷頓外展項目，一種修復方法是將兩個切口粘在一起。這種被稱為「非同源末端連接」的方法容易引入錯誤。核苷酸意外插入或刪除，導致突變，從而破壞基因。在第二種方法中，通過用核苷酸序列填充間隙來固定斷裂。為了做到這一點，細胞使用短鏈DNA作為模板。科學家可以提供他們選擇的DNA模板，從而寫入他們想要的任何基因，或糾正突變。
實用性和局限性
CRISPR-Cas9近年來變得流行起來。Church指出，這項技術易於使用，其效率大約是之前最好的基因組編輯工具（稱為TALENS）的四倍，美國麻省理工學院和哈佛大學博德研究所的丘奇和張峰實驗室的研究人員首次發表了在實驗環境中使用CRISPR-Cas9編輯人體細胞的報告。利用人類疾病的體外（實驗室）和動物模型進行的研究表明，該技術可以有效地糾正遺傳缺陷。根據《自然生物技術》雜志2016年發表的一篇評論文章，此類疾病的例子包括囊性纖維化、白內障和范科尼貧血。這些研究為人類的治療應用鋪平了道路。
「我認為公眾對CRISPR的認識非常集中於臨床上使用基因編輯治療疾病的想法，」紐約基因組中心的內維爾·桑賈納和紐約大學生物、神經科學和生理學助理教授說這無疑是一個令人興奮的可能性，但這只是一小部分。
CRISPR技術也被應用於食品和農業工業，以設計益生菌培養物和疫苗食用工業培養物（例如酸奶）以防病毒。它還被用於提高作物的產量、耐旱性和營養特性。
另一個潛在的應用是創造基因驅動。這些是遺傳系統，它增加了一個特殊的性狀從父母傳給後代的機會。最終，根據Wyss研究所的研究，這種特性會在幾代人中傳播到整個群體。根據2016年《自然生物技術》的文章，基因驅動可以通過增強疾病載體（雌性甘比亞按蚊）的不育性來幫助控制瘧疾等疾病的傳播。此外，根據Kenh Oye及其同事在2014年發表在《科學》雜志上的一篇文章，基因驅動也可用於根除入侵物種，逆轉對殺蟲劑和除草劑的抗性，Church告訴Live Science：「CRISPR-Cas9並非沒有缺點，
」「我認為CRISPR最大的局限是它沒有百分之百的效率。」。此外，基因組編輯效率可能會有所不同。根據Doudna和Charpentier在2014年發表的一篇科學文章，在一項在水稻上進行的研究中，接受Cas9 RNA復合物的細胞中，近50%發生了基因編輯。然而，其他的分析表明，根據目標，編輯效率可以達到80%或更高。
也有「目標外效應」的現象，即DNA在目標以外的位置被切割。這可能導致意外突變的引入。此外，丘奇還指出，即使系統按目標進行了削減，也有可能得不到精確的編輯。他稱之為「基因組破壞」。
設定了CRISPR技術的許多潛在應用提出了關於篡改基因組的倫理價值和後果的問題。
在2014年的科學文章中，Oye和同事們指出了使用基因驅動器的潛在生態影響。一個引進的性狀可以通過雜交從目標群體傳播到其他有機體。基因驅動也會降低目標群體的遺傳多樣性。
對人類胚胎和生殖細胞（如 *** 和卵子）進行基因修飾被稱為生殖系編輯。由於這些細胞的變化可以遺傳給下一代，使用CRISPR技術進行生殖系編輯已經引起了許多倫理問題。
的可變功效、偏離目標的效果和不精確的編輯都會帶來安全風險。此外，還有許多科學界尚不清楚的問題。在2015年發表在《科學》雜志上的一篇文章中，大衛巴爾的摩和一組科學家、倫理學家和法律專家指出，生殖系編輯增加了對後代產生意外後果的可能性，「因為我們對人類遺傳學、基因與環境相互作用的知識有限，以及疾病的途徑（包括一種疾病與同一病人的其他情況或疾病之間的相互作用）。
其他倫理問題更為微妙。我們是否應該在未經後代同意的情況下，做出可能從根本上影響後代的改變？如果使用生殖系編輯從一種治療工具轉變為一種增強工具，以適應各種人類特徵，會怎麼樣？
為了解決這些問題，國家科學、工程和醫學院編寫了一份全面的報告，其中包括基因組編輯的指導方針和建議。
盡管國家科學院敦促謹慎從事生殖系編輯，他們強調「謹慎並不意味著禁止」，他們建議只在導致嚴重疾病的基因上進行生殖系編輯，並且只有在沒有其他合理的治療方法的情況下才進行。在其他標准中，他們強調需要有關於健康風險和益處的數據，以及在臨床試驗期間需要持續監督。他們也推薦
最近的研究最近有許多基於CRISPR的研究項目生物化學家和CRISPR專家薩姆·斯特恩伯格（Sam Sternberg）說：「由於CRISPR，基礎研究發現的速度已經爆炸了。」他是加利福尼亞州伯克利市Caribou Biosciences Inc.的技術開發小組負責人，該公司正在開發基於CRISPR的醫葯、農業解決方案，以及生物研究。
這里是一些最新的發現：
在2017年4月，一個研究小組在《科學》雜志上發表了一項研究，他們編寫了CRISPR分子程序，在血清、尿液和唾液中發現寨卡病毒株。2017年8月2日，科學家在《自然》雜志上披露，他們已經成功使用CRISPR去除了胚胎中的心臟病缺陷。2018年1月2日，研究人員宣布，他們可能能夠阻止真菌和其他威脅巧克力生產的問題，使用CRISPR使植物更具抗病性。根據《生物新聞》（BioNews）雜志發表的研究報告，2018年4月16日，研究人員將CRISPR升級為一次編輯數千個基因。」「Live Science contributor Alina Bradford的附加報告」
附加資源
Broad Institute:CRISPR基因工程和生物技術關鍵工作的時間表新聞：CRISPR-Cas9被合成核苷酸Broad Institute改進了10000倍：關於CRISP的問題和答案
Ⅷ CRISPRa基因過表達技術
上回說到，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活。基因過表達、基因干擾、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。
基因過表達技術，通常是指將目的基因的ORF構建到組成型啟動子或組織特異性啟動子的下游，通過載體轉入某一特定細胞中，實現基因表達量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉座子載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等多種類型。當基因表達產物超過正常水平時，觀察該細胞的生物學行為變化，從而了解該基因的功能。
CRISPRa(轉錄激活)，作為基因過表達技術的新成員，是通過催化失活的Cas9（dCas9）連上轉錄激活子，來實現促進基因組特定位點的轉錄。
目前CRISPRa已經發展出好幾個新版本。MIT的CRISPR先驅張鋒通過改造dCas9和sgRNA優化了轉錄機器的招募，成功將RNA表達水平提升了一個數量級。張鋒團隊用自己的改良版CRISPRa激活了十個基因,研究顯示，這些基因的轉錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個數量級的增加。他們發現，CRISPRa離轉錄起始位點越近，轉錄激活的效果就越強。如果CRISPRa靶向轉錄起始位點的上游（超過200bp），觸發的轉錄就會更為溫和，更接近生理水平。通過這一途徑揭示了基因表達量與表型強度之間的線性關系。
加州大學的Jonathan Weissman研究團隊在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當於一套分子掛鉤，能在細胞中招募多拷貝的轉錄激活子，生成強勁的信號。
綜合看CRISPRa（基因激活）系統是用於轉錄激活內源性基因的強大工具。完整的CRISPRa系統包含三個組分，每個組分分別由單獨的載體提供：gRNA/MS2表達載體，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體。
gRNA/MS2表達載體，包括兩個138-nt發夾RNA適體，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結合位點。這些閉孝橋發夾RNA適體與gRNA連接，有利於高效募集MS2-融合蛋白。
MS2/P65/HSF1輔助載體驅動由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結構域）組成的三結構域融合蛋白的表慎圓達。
dCas9/VP64輔助載體驅動催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結構域融合蛋白的表達。
當這三種載體共轉導細胞時，用戶定製的gRNA可能會募集MS2/轎猛P65/HSF1（通過MS2結合發夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過CRISPR/Cas9復合物組裝） 到gRNA靶位點，從而組裝出強大的SAM復合物。這些SAM復合物可通過VP64，p65和HSF1激活結構域之間的協同作用實現靶位點的強烈轉錄激活。
該載體系統可用於激活單個或一系列基因的轉錄，也可用於基因組的大規模篩選，使用gRNA序列文庫來產生gRNA/MS2表達載體文庫。
Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.
J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi: 10.4014/jmb.1705.05081.
CRISPR a vs ORF 傳統過 表達 技術
相比於傳統ORF穩轉過表達技術，CRISPRa通過激活內源性啟動子高效轉錄，從而促進基因表達，不需要額外構建外源性表達元件，不受基因轉錄本大小的限制。
Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.
因此，CRISPRa技術在長轉錄本基因過表達研究、單基因多轉錄本的整體激活研究具有不可替代的優勢。
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Ⅸ 如何提升crispr效率
01
大多數植物基因組編輯研究利用來自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-Cas9系統（SpCas9）。spCas9的識別依賴於特定的PAM序列NGG，這大大限制了該系統的編輯位點選擇范圍困啟。為了解決這個問題，研究人員們從不同方向入手，尋找解決的辦法。
2016年3月，中國水稻研究所王克劍課題組的研究人員通過對Cas9蛋白進行定點突變，獲得了Cas9蛋白的VQR變體，並在水稻基因組中成功實現對NGA鄰近序列的編輯，極大的擴展了基因編輯位點的選擇范圍（Hu et al.,2016）。然而CRISPR-Cas9-VQR系統與原CRISPR-Cas9系行尺橋統相比較，其編輯效率依然偏低，這限制了該系統在水稻中的推廣應用。
2017年6月12日，王克劍團隊與中科院遺傳與發育生物學研究李家洋團隊合作，在Plant Biotechnology Journal發表了題為「Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice」的文章( Hu et al.,2018)，通過優化sgRNA的結構以及使用水稻內源性強啟動子來驅檔猛動Cas9及VQR變體的表達，顯著提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系統在水稻中的基因組編輯效率。通過試驗，水稻中的編輯效率最高可達到近80%，提升幅度最高可達8倍。於此同時，該系統可以通過同位酶連接方式串聯多個sgRNA同時進行多位點編輯（構建方法可參考王克劍團隊王春博士2015年發表在Journal of Genetics and Genomics上的文章; Wang et al.,2015）。在多位點編輯時，效率提升幅度更加明顯，可以達到15倍。因此，修飾後的CRISPR-Cas9-VQR系統將成為多NGA靶標位點編輯的強大工具。