race技術由哪裡發明的

『壹』 已知部分基因序列,如何獲得全長基因

基因是遺傳物質基本的功能單位，分離和克隆目的基因是研究基因結構、揭示基因功能及表達的基礎，因此，克隆某個功能基因是生物工程及分子生物學研究的一個重點。經典克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病, 即實驗操作繁瑣, 周期較長、工作量繁重,且不易得到全長序列。又由於在不同植物中目的基因mRNA豐度不同，所以獲得目的基因的難易程度又不一樣，特別是對於豐度比較低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能獲得成功。近年來隨著PCR技術的快速發展和成熟.已經有多種方法可以獲得基因的全長序列, 比如經典的RACE技術，染色體步移法和同源克隆法等，本文主要綜述幾種重要的克隆方法的原理和老笑困運用，並且比較分析這幾種方法的優缺點，為你的實驗節約時間和成本。
1. RACE技術
1985年由美國PE-Cetus公司的科學家Mulis等[1]發明的PCR技術使生命科學得到了飛躍性的發展。1988年Frohman等[2] 在PCR技術的基礎上發明了一項新技術, 即cDNA末端快速擴增技術( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其實質是長距PCR( long distance, PCR)。通過PCR由已知的部分cDNA 序列, 獲得5′端和3′端完整的cDNA, 該方法也被稱為錨定PCR ( anchored PCR) [3] 和單邊PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技術又分為3』RACE和5』端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作為一個引物結合位點進行PCR, 以Oligo( dT) 和一個接頭組成的接頭引物( adaptor primer, AP)反轉錄mRNA得到加接頭的第一鏈cDNA。然後用一個正向的基因特異性引物( gene-specific primer, GSP) 和一個升緩含有接頭序列的引物分別與已知序列區和poly(A) 尾區退火, 經PCR擴增位於侍念已知序列區域和poly( A) 尾區之間的未知序列，若為了防止非特異性條帶的產生, 可採用巢式引物( nested primer) 進行第二輪擴增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5』RACE跟3』RACE原理基本一樣，但是相對於3』RACE來說難度較大。
5'-RACE受到諸多因素的影響而常常不能獲取全長，因此研究者都著手改進它。這些措施主要是通過逆轉錄酶、5'接頭引物等的改變來實現的，因此出現了包括基於「模板跳轉反轉錄」的SMART RACE技術( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基於5′脫帽和RNA酶連接技術的RLM-RACE技術(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA連接酶為cDNA第一鏈接上寡聚核苷酸接頭的SLC RACE技術(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以內部環化的cDNA第一鏈為模板進行擴增的自連接或環化RACE技術(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通過末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾後引入錨定引物的錨定RACE技術( anchored RACE)[11]。
1.1基於『模板跳轉』的SMART RACE技術
SMART-RACE技術的最大特點是5′ RACE過程中的「模板跳轉」現象,即當反轉錄進行到mRNA模板的5′末端時,反轉錄酶表現出末端轉移酶活性,在第一鏈cDNA的3′端加上3-5 個殘基(主要是dC) ,隨後第一鏈cDNA與3′端含幾個dG的寡核苷酸引物退火,使反轉錄反應發生跳移,以引物中寡核苷酸為模板繼續進行,最終反轉錄所得產物必然包含完整的mRNA5′末端序列及引物序列,可直接用於RACE-PCR獲得完整地5′ cDNA末端。由於上述過程無需接頭連接,而且直接以第一鏈cDNA作為模板進行RACE-PCR ,因此更加簡便、快捷。另外,SMART -RACE還採用了降落PCR、抑制PCR、LD - PCR 等先進擴增技術,提高了PCR擴增的敏感性和真實性,降低了非特異的產物背景,因此該技術已被廣泛應用於cDNA末端快速擴增,尤其是5』端的克隆。
1.2末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾技術
傳統的5′RACE反應是以TdT對第一鏈cDNA進行同聚物加尾來引發第二鏈cDNA的合成[12] ,這種方法經常會導致RACE反應失敗或產生一些副產品。其主要原因是同聚物加尾反應難以控制,TdT 加尾時不能區分cDNA是否是全長,非全長cDNA分子被加尾後將在隨後的PCR反應中得到優先擴增,從而產生大量的非特異性產物背景，並且TDT的加尾效率比較低[13]。目前許多研究這對其進行了改進。
夏瑞等[11]提出了一種改良的TDT加尾克隆基因5』端的方法。其首先用1個15 bp左右的特異反轉錄引物代替通用反轉錄引物Olig( dT) n對模板cDNA進行初步篩選,使合成的cDNA更靠近目的基因的5′端。其次, 兩個上游引物採取巢式策略取代一般的poly( dG)n或poly ( dC)n，從而控制第二輪PCR的退火溫度, 保證擴增的特異性。並且在PCR過程中採用了如錨定PCR、巢式PCR、降落PCR等方法增加擴展產物的特異性。這些新的改進使得到目的條帶的概論增加，並且反轉錄引物不需要磷酸化, 從而大大節約實驗成本。
2.染色體步移法
染色體步行(chromosome walking)是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關系的目的序列核苷酸組成的方法和過程14]。對於基因組測序已經完成的少數物種(水稻、擬南芥等)來說，可以輕松地從資料庫中找到已知序列的側翼序列。但是這畢竟只是研究少數模式植物時的情況，對於自然界中種類繁多的其植物而言，在不知道它們的基因組DNA序列以前，想要知道一個已知區域兩側的DNA序列，只能採用染色體步移技術。因而，染色體步移技術在現代分子生物學研究中佔有舉足輕重的地位，是結構基因組研究以及功能基因組研究的基礎。
目前,分離側翼序列的染色體步移方法主要有兩種,一是結合基因組文庫為主要手段的染色體步移技術,構建基因組文庫進行染色體步移盡管步驟比較繁瑣,但是適於長距離步移,可以獲得代表某一特定染色體的較長連續區段的重疊基因組克隆群。隨著亞克隆文庫條件構建條件的優化及測序技術的進步,這種方法也將更加快捷,准確。另一個是基於PCR擴增為主要手段的染色體步移技術。基於PCR擴增為主要手段的染色體步移技術步移距離相對較短,但是操作比較簡單,尤其適合於已知一段核苷酸序列的情況下進行的染色體步移。反向PCR、外源接頭介導PCR和熱不對稱交錯PCR(TAIl-PCR)等就是建立在PCR技術基礎上的染色體步行技術，為擴增已知序列旁側的未知DNA片段提供了捷徑．這些方法的建立可以不必經過煩瑣的建庫和篩選過程而獲得全長基因序列．
2.1連接介導PCR
連接介導聚合酶鏈反應是以連接反應為基礎的單側PCR技術，首先通過基因組DNA酶切，在酶切後的DNA片段的一端連接上一個公共連接子，而後用這個連接子為引物與另一個基因特異引物進行擴增，得到了包含連接子在內的基因序列。連接介導PCR又分為連接載體的PCR、連接單鏈接頭的PCR和連接雙鏈接頭PCR。此方法原理簡單,操作方便。
2.1.1連接載體的PCR
連接載體的PCR是利用已知基因組DNA序列設計的特異引物和載體通用引物進行擴增獲得目的片段的一項PCR技術。操作方法是首先用內切酶酶切基因組DNA和載體質粒DNA，得到小片段DNA和線形字體序列，然後用T4連接酶把載體序列與DNA小片段相連接，以連接產物為模板，以一個基因特異引物和載體引物進行擴展，通過克隆測序得到未知的側翼序列。
2.1.2連接單鏈接頭的PCR
連接單鏈接頭的PCR又叫鍋柄PCR，是連接單鏈接頭PCR的典型代表,因其以一個類似鍋柄結構的DNA分子為模板而得名[18]。其基本原理是：將基因組總DNA 用能產生5' 端突出末端的內切酶切割；接著連上一條單鏈的寡核苷酸，其具有兩個特點，其一是5'端和限制性片段的突出末端互補，其二是除此以外的序列必須和已知序列中一段完全同源；在PCR 的復性階段，外源接頭就會和其鏈內同源序列配對而成一個末端部分封閉的分子內環狀結構，在TaqDNA 聚合酶的作用下，沿著3' 端將單鏈部分完全補平後而形成一個鍋柄結構，因此這種方法也被稱為鍋柄PCR。由於其末端是一個反向重復序列，故最後只需一條引物即可完成對目標區段的擴增。
2.1.3連接雙鏈接頭PCR
雙鏈接頭法也稱為adapter介導的PCR法[ 19，20]。其主要過程為首先用能夠產生粘性末端的限制性內切酶消化基因組DNA,然後將末端配對的接頭和限制性片段連接,以其作模板,用接頭引物和已知序列特異引物進行PCR擴增,即可獲得包含側翼序列的目標片段。顯然，這類方法存在一個問題：即如何抑制接頭到接頭的非目標擴增。因此許多研究者由對其進行了改進，出現了抑制PCR，多功能接頭PCR和T接頭PCR[21]。
2.2熱不對稱交錯PCR(TAIl-PCR)
熱不對稱性PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)就是建立在PCR技術基礎上的染色體步移技術，為擴增已知序列旁側的未知DNA 片段提供了捷徑。該技術由Liu和Whitter於1995年首先研究並報道[22]。以基因組DNA為模板，使用高退火溫度的長特異引物和短的低退火溫度的簡並引物，通過特殊的熱不對稱(高嚴謹性PCR和低嚴謹性PCR交替)循環程序，有效擴增特異產物。該技術具有簡單快速、特異性高、分離出的DNA 序列可以用於圖位克隆、遺傳圖譜繪制和直接測序等優點，近年來，被分子生物學研究者廣泛應用，成為分子生物學研究中非常實用的基因側翼序列克隆技術，同時在植物基因克隆方面也取得了很大進展。
TAIL-PCR技術的基本原理是利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物(special prime ,簡稱sp1 ,sp2 ,sp3 ,約20 bp) ,用它們分別和1個具有低Tm值的短的(14 bp) 隨機簡並引物(Arbitrary degenerate prime 簡稱AD)相組合,以基因組DNA作為模板,根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環,通過分級反應來擴增特異引物。
TAIL-PCR包括3輪PCR反應。第1輪PCR反應包括5次高嚴謹性反應、1次低嚴謹性反應、10次較低嚴謹性反應和12次熱不對稱的超級循環。首先5次高嚴謹性的反應，使長的高退火溫度的特異引物SPl與已知的序列退火並延伸，目標序列擴增成直線性型上升，由AD引物結合產生的非特異性產物的濃度則較低。而後進行1次低退火溫度的反應，目的是使簡並引物結合到較多的目標序列上，接下來10次較低嚴謹性的反應可以使兩種引物均能與模板退火，從而使原來由高嚴謹性循環所產生的單鏈靶DNA復製成雙鏈DNA，為下一輪線性擴增模板做准備。最後是進行12次熱不對稱的TAIL循環(超級循環即高特異性和低特異性循環交替)，目的片段得以指數性地擴增，擴增的量大大超過了非目標片段。經過上述一系列的反應得到了不同濃度的3種類型產物：TAIL-PCR中間會出現3 種類型的產物。類型1是特異引物和任意引物之間擴增的產物（即目標產物；類型2是單獨由特異引物擴增的產物；類型3是單獨由任意引物引發的產物。該方法由3步連續的PCR擴增過程構成。經過第一階段的PCR擴增後，類型2產物的分子數目在3種產物中最多，類型1產物稍低。在第二階段的擴增中，類型1產物的分子數逐漸升至最高，類型2分子數目基本保持不變，而類型3的分子數目仍然保持很低。在第三階段結束後，基本上只有類型1產物，即目的產物。
TAIL-PCR的技術難點，首先是引物設計，和一般的PCR反應相比，TAIL-PCR反應對引物的要求較高，引物的設計很是重要。特異性引物和簡並引物的選擇直接影響擴增的效果。特異引物設計：3個嵌套的特異性引物長度一般在20~30 bp之間，Tm 值一般設為58~68℃。SP1、SP2 和SP3之間最好相距100 bp以上以便在電泳時更容易區分3輪PCR產物。簡並引物是按照物種普遍存在的蛋白質的保守氨基酸序列設計的，相對較短，長度一般是14 bp左右，Tm值介於30~48℃之間。AD引物是否最佳與它的簡並度、引物長度和核苷酸序列組成有很大關系。
目前一些研究這又對TAIL-PCR進行了該進，比如省去了10個中等嚴謹度的PCR循環，3次PCR循環中的變性時間由5 s延長到了30 s,更有利於DNA徹底解鏈，第3次循環增加了熱不對稱交織PCR,更有利於特異目的片段的富集，把較低特異性反應的溫度從44℃降到29℃等，以利於更好的擴增目的片段。
3 .RACE技術與染色體步移方的比較
3.1 SMART-RACE與末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾技術的比較
SMART-RACE技術是目前一種比較成熟的技術，它能夠最大限度地提高在反轉錄反應中獲取全長cDNA的可能，成功率高，可以節約時間並且操作程序簡單，但是於價格過於昂貴, 試驗成本增加, 而且對RNA質量要求很高。TdT加尾擴增法的優化改良, 成功率和穩定性都得到較大的提高，改良的TdT末端加尾擴增法綜合了多項PCR擴增方法如錨定PCR、巢式PCR、降落PCR等, 原理簡單易懂, 操作性強，能夠滿足一般基因克隆的要求。
3.2連接介導PCR與TAIL-PCR的比較
連接介導PCR原理簡單，但其需要DNA內酶切酶切，而內酶切又比較昂貴，增加實驗的成本。並且酶切的好壞，接頭處理方法是否得當而影響接頭與DNA小片段的連接效率，從而導致失敗。TAIL-PCR不需要進行DNA酶切而直接用DNA做模板進行擴增，僅僅只需要三輪PCR擴增，就可以得到目的條帶。簡單、特異性高、高靈敏度、快速、不涉及連接反應這就是TAIL-PCR的優點，但是TAIL-PCR也有缺點，主要是TAIL-PCR 反應需要較多的引物組合。此外,由於AD引物存在有限的結合位點,對於個別的側翼序列,即使使用不同的簡並引物也難以擴增到陽性結果。目前已經有學者提出用RAPD的引物替代AD引物的觀點，由於RAPD引物數量很多，所以可以解決AD引物存在有限的結合位點的不足。
4.總結
RACE是一種快速、有效的克隆基因全長cDNA的有效方法。基因的3』端通過RACE技術非常容易得到，但是5』端卻比較難，即使用比較昂貴的5』端RACE試劑盒也不一定能得結果。而基於PCR擴增的染色體步移法，卻有得天獨厚的優勢，它不僅僅能用於基因全長的獲得而且還可以得到基因5』端的啟動子序列。模板僅僅只要基因組DNA就行，原理簡單易懂，操作方法也簡單易行，並且非常的廉價，適用於不同水平和不同層次的研究者。筆者通過TAIL-PCR技術成功得到了芒果LFY基因的全長及其啟動子序列。

『貳』 生物實驗中的RACE是什麼技術

RACE 是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術,通卜態雹型帆過往兩端延伸擴增,獲得閉鏈cDNA完整的3'端或5'端

『叄』 生物實驗中的RACE是什麼技術

RACE (rapid-amplification of cDNA ends) 是通過PCR進行cDNA末端頌李快速宏塵克隆的技術,通過往兩端延伸擴增,獲得cDNA完整的3'端或5'端野絕遲.http://ke..com/link?url=-o...

『肆』 跨欄跑和奧運會110米欄冠軍成績演變

中國選手劉翔在男子110米欄決賽中以12秒91獲得金牌！悉亂他創造了中國乃至亞洲的歷史，成為第一睜櫻檔個獲得奧運田徑短跑項目世界冠軍的黃種人，這個成績打破了奧運會紀錄，並且頌毀平了世界紀錄！

『伍』 RACE技術的技術原理

SMARTTM 3'-RACE原顫彎雀理
利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉茄早錄合成標准第一鏈cDNA。然後用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環，把目鬧檔的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。（見下圖）

SMARTTM 5'-RACE原理
先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標准第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5' 末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火後(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接頭引物配對後，轉換為以SMART序列為模板繼續延伸而連上通用接頭（見下圖）。然後用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。

最終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。

『陸』 急求RACE-PCR原理！！！

多是多了點，這樣好有一個全面的認識
第一 RACE的簡介

目前,全長基因的獲得是生物工程及分子生物學研究的一個重點。盡管已經有多種方法可以獲得基因的全長序列，但在很多生物研究中，由於所研究的目的基因豐度較低，從而使得由低豐度mRNA通過轉錄獲得全長cDNA很困難。近年來發展成熟的cDNA末端快速擴增(RACE)技術為從低豐度轉錄快速纖仔獲得全長 cDNA提供了一個便捷的途徑。

cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術是一種基於mRNA反轉錄和 PCR技術建立起來的、以部分的已知區域序列為起點,擴增基因轉錄本的未知區域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉錄本中快速增長cDNA5』和cDNA3』末端，進而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優點,可同時獲得多個轉錄本。因此近年來RACE技術已逐漸取代了經典的cDNA文庫篩選技術,成為克隆全長cDNA序列的常用手段。

第二 RACE的原理

RACE 是採用PCR 技術由已知的部分cDNA 順序來擴增出完整cDNA5』和3』末端,是一種簡便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。

3』RACE的原理

一)加入oligo(dT)17和反轉錄酶對mRNA進行反轉錄得到(-)cDNA；

二)以oligo(dT)l7和一個35bp的接頭(dT17-adaptor)為引物，其中在引物的接頭中有一在基因組DNA中罕見的限制酶的酶切位點。這樣就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個基因特異性引物(3 amp)與少量第一鏈(-)cDNA退火並延伸，產生互補的第二鏈(+)cDNA。

三)利用3amp和接頭引物進行PCR循環即可擴增得到cDNA雙鏈。擴增的特異性取決於3amp的鹼基只與目的cDNA分子互補．而用接頭引物來取代dT17一adaptor則可阻止長(dT)鹼基引起的錯配。

5』RACE的原理

5』RACE與3』 RACE略有不同。首先，引物多設計了一個用於逆轉錄的基因特異引物GSP-RT；其次，在酶促反應中增加返首了逆轉錄和加尾步驟，即先用GSP-RT逆轉錄 mRNA獲得第一鏈(-)cDNA後， 用脫氧核糖核酸末端轉移酶和dATP在cDNA5』 端加poly(A)尾，再用錨定引物合成第二鏈(+)cDNA,接下來與3』 RACE過程相同。用接頭引物和位於延伸引物上游的基因特異性引物(5amp)進行PCR擴增。

全長cDNA的獲得

通過RACE方法獲得的雙鏈cDNA可用限漏豎數制性內切酶酶切和southem 印跡分析並克隆。通常的克隆方法是同時使用一個切點位於接頭序列上的限制性內切酶和一個切點位於擴增區域內的內切酶。由於大多數非特異性擴增的cDNA產物不能被後一個限制性內切酶酶切，因而也就不會被克隆．從而增加了克隆的選擇效率。還可以用在基因特異性引物的 5』端摻人一個限制性內切酶的酶切位點的方法來克隆。最後，從兩個有相互重疊序列的3』和5』RACE產物中獲得全長cDNA。或者通過分析RACE產物的3』和5』端序列，合成相應引物來擴增mRNA的反轉錄產物，從而獲得全長cDNA。

第三 RACE的應用

RACE技術主要是應用於對全長cDNA序列的獲得，但對該技術進行一定的修改後，也可在其它方面顯示出極高的應用價值。

首先，RACE技術可用於cDNA文庫的構建及篩選。Belyavaasky等(1989)用10個骨髓瘤細胞分離的總RNA，通過TdT加同聚尾、(dT)16引物反轉錄，接著用(dC)13和錨定引物擴增的方法建立了一個106克隆的cDNA 文庫。同時，用該方法構建文庫的優點是它們都只需要很少量的實驗材料。建喜等(2001)利用RACE技術從已經構建的cDNA 文庫中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。

其次，應用RACE克隆已知片段的旁側內部序列(neighboring internal sequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分別用該法獲得了3』端和5』端的旁側序列。Zhang (1996)應用LA-PCR方法獲得了特異基因的5』末端非編碼和編碼序列,省去了構建及篩選基因組文庫的麻煩。王東等(2003)利用RT-PCR和 RACE技術從玉米中獲得一個長度為2469bp F2KP蛋白基因的cDNA克隆。此外，RACE技術還可用於克隆同源基因的同源片斷，為尋找同基因提供了一種方法。

除此之外,Whitcomb等設計的隨機引物/錨定PCR能對克隆質粒載體上的靶序列進行定點刪除，採用(N)10錨隨機引物和變性的質粒DNA進行雜交,然後通過T7聚合酶來延伸,這樣單鏈DNA就可被一隨機引物和一基因特異性引物擴增,一端可達到缺失刪除,缺失的片段可達2Kb。Balavoine應用連接介導PCR從一種扁蟲中克隆得到8個分別屬於Hox,msh,NK-1和NK-2的含同源盒的片段，說明RACE可用於克隆同源基因的同源片段，為尋找同源基因提供了一種手段。

RACE技術與生物信息學,例如EST庫相結合,具有快速,高效克隆新基因的特點,為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路,如果一個基因是多基因家族的一個成員,用基因特異引物(GSP)可能同時擴增幾個高度同源的Cdna.李紅等利用一條cDNA作為探針,通過BLASTN從GenBank中整合出了7條更長的EST,通過設計引物,利用RACE擴增,得到了7條新基因.相比單純尋找新基因的全長,此種方法的結合充分利用了信息巨大的基因資源庫,得到了更多的信息,獲得新基因速度更快*效果更高,屬一種頗具規模化的方法,很有應用前景。

總之,隨著RACE技術的不斷改進和完善,優化PCR擴增的條件以提高擴增的效率和忠實性，RACE技術必將在基因克隆以及基因家族和基因表達變化等研究中發揮極大的作用。

第四 RACE的優點與局限性

RACE技術相對於其他方法克隆全長cDNA來說具有價廉、簡單和快速等特點。用RACE獲得cDNA克隆只需幾天的時間，而且對豐度很低的起始反應物質，照樣能迅速反饋是否有目的產物生成。因此，可根據不同的RNA制備來修訂反轉錄條件，以滿足全長cDNA的獲得。同時，通過RACE技術獲得5』端調控序列和多聚腺苷化信號序列的信息，有助於選擇引物以用於轉錄模型非常復雜的基因中擴增cDNA的亞群。另外，RACE技術能產生大量獨立克隆，這些克隆可用來證實核苷酸序列，並使得被選擇性剪接或開始用於很少使用的啟動子的特殊轉錄物的分離成為可能。

RACE技術從理論上來說是很簡單的，但是實際操作中會面臨許多技術上的難題。許多研究人員發現，利用RACE來獲得全長基因並非如想像中那般成功,甚至經常會發生錯誤的擴增和克隆結果, 多數情況下,5』端的編碼區經常會由於反轉錄過程的不徹底而丟掉,特別是由於有大的轉錄物或者存在復雜的二級結構的時候,而且連接反應通常是特異性差效率很低,這樣PCR成功進行就不能保證.尤其在長片段擴增時,PCR就顯得不那麼有效.例如幾個Kb片段的產物就需要優化改變擴增條件，而且擴增結果經常出現非特異性擴增條帶,使得選擇目的條帶變得十分困難,而對於豐度較低,長度較長的基因RACE方法困難更大,這是困擾研究人員的一大難題。由於RACE擴增中經常出現由於引物的不匹配而導致的非特異性擴增,有時需要進行幾輪巢式擴增來達到獲得特異性擴增的目的,然而多輪擴增又容易提高PCR反應的錯誤發生率,由於這些原因,利用RACE技術通常不易獲得所希望的結果。

盡管RACE技術在應用中取得了很大的成功．但在實際操作過程仍有不少局限性。一般來說導致失敗的原因主要有二：第一，在逆轉錄、TdT加尾、PCR擴增這三個連接的酶促反應過程中，任何一步的失敗都會導致前功盡棄；第二，即便是上述反應平穩順利．但結果也通常會出現一些非特異性產物或非全長的產物。因此，要保證RACE技術的順利進行，還需從不同方面進行改良優化。

『柒』 Race是什麼牌子

RACE技術的簡介
cDNA完整序列的獲得對基因結構、蛋白質表達、基因功能的研究至關重要。
完整的cDNA 序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術獲得。
末端克隆技術是20世紀80年代發展起來的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術。

RACE的優點
與篩庫法相比較，有許多方面的優點
1）此方法是通過PCR技術實現的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。
2）節約了實驗所花費的經費和時間。
3）只要引物設計正確，在初級產物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。

實驗室現有的RACE試劑盒的簡介
RACE是一種從一個相同的cDNA模板進行5『和3『末端快速克隆的方法。此方法會產生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。
使用此方法的要求是必須知道至少23－28個核苷酸序列信息，以此來設計5』末端和3『末端RACE反應的基因特異性引物（GSPs）。

RACE引物的設計：
基因特異性引物（GSPs）應該是：
23－28nt
50－70％GC
Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結果
需要實驗者根據已有的基因序列設計5『和3『RACE反應的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由於兩個引物的存在，PCR的產物是特異性的。

反應中涉及到的一些事項
cDNA的合成起始於polyA RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。
RACE PCR的效率還取決於總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。
在進行告埋5『和3』RACE PCR的時候應該使用熱啟動。
表4中給出了所有引物的相互關系。重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。並不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列，否則會產生回折和
如果要用重疊片段來檢測設計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200鹼基。只有這樣才可襪衫螞以用擴增的產物塌好來鑒定設計的引物是否正確。
降落PCR可以明顯的增加RACE PCR產物的特異性。在最開始的循環中，退火溫度高於AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴增。隨後的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進行隨後的PCR循環。
形成分子內氫鍵。另外，避免使用與AP1互補的引物，尤其是在3『末端。

驗證基因特異性引物的對照：
單個引物的陰性對照：只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物，應該改變循環的參數，或重新設計原始引物。
利用兩個GSPS進行陽性對照：（只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以採用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實表達，利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產生陽性對照。可以產生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應該重復cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。
制備和抽提polyA RNA
不要使用DEPC處理過的水。
純化完mRNA之後，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小。

具體的實驗步驟
cDNA第一條鏈的合成：
我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之後，在氣浴中42度保溫一個小時。
注意： 在水浴或酒精浴中保溫回減少反應體積，從而降低第一鏈的合成效率。
將管放於冰上，以終止第一鏈的合成反應。
直接進行第二鏈的合成。
cDNA第二鏈的合成：
第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。
建議進行陽性對照,cDNA的質量取決於制備的polyA RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。
通過電泳檢測cDNA的產量，與對照進行對比，這樣可以有利於在以後的步驟中對cDNA進行稀釋。

接頭的連接及連接產物的稀釋
按照程序進行連接反應。
如果沒有對比樣品和對照的產量，利用Tricine－EDTA buffer制備接頭連接的ds cDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。

RACE－PCR擴增
進行5』和3』的RACE－PCR擴增。
利用以下的程序進行降落PCR反應：

注意：
我們建議使用降落PCR反應，這就要求GSP的Tm值≥70度。

當循環結束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl，使用適當的分子量marker。
可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決於擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經常使用4min，0.2-2kb的時候將延伸時間減到2－3min，對於5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。

RACE產物的驗證：
應該對RACE的片段進行驗證,以此來確定是否已經擴增了理想的產物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗證是非常有用的。
有3種驗證RACE產物的方法：
（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。
（2）Southern blot
（3）克隆並測序
我們建議最好測得RACE產物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。

比較由GSP和NGSP獲得RACE產物
對於5『末端的RACE產物，比較由AP1和GSP1擴增出來的產物和由AP1和NGSP1擴增出來的產物。
對於3『末端的RACE產物，比較由AP1和GSP2擴增出來的產物和由AP1和NGSP2擴增出來的產物。這對於鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產物是非常有用的。
如果條帶是正確的，在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR產物的遷移率的不同取決於cDNA結構中GSP1和嵌套引物的位置。

RACE產物的克隆和測序：
可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產物，此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對於長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。

電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。
將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點，將產物克隆到常規載體中.
對於5『端的RACE產物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5『端的最大可能性的序列。（反轉錄並不總是進行到mRNA模板的5』末端，尤其是長模板。另外，T4 DNA聚合酶會移走5『末端的0－20個鹼基。）
一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5『和3『的非翻譯區。

全長cDNA的獲得
通過部分或全部測序鑒定了RACE產物後，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
擴增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以產生拖帶，所以要慎重的設計引物。
根據從5『和3『RACE產物獲得序列信息設計5』和3『GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3』或者5『的末端，應該是23－28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點，這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3』和5『的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。
進行如下的熱循環：
94度 30秒
25個循環 94度 5秒
72度 2－15分鍾
延伸的時間應該等於預期的cDNA長度加上2分鍾。例如：預期得到6kb的條帶，用6＋2＝8分鍾的延伸時間。
注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加5個循環；或者優化PCR的條件。
在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的cDNA。
制備1.2%的TAE buffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer，TBE的膠很難制備全長的cDNA。
將剩下的45μl反應物點樣，選用適當的marker。
利用長波紫外觀察cDNA（≥300nm）切下全長的cDNA。注意：應該盡量減少紫外對cDNA的照射。
利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對於長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。
將全長的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆載體中。

通過克隆產生全長的cDNA：
如果你已經獲得了含有重疊部分的5『和3』RACE產物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話，通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。
利用酶切獲得的3『和5』擴增產物，並且利用T4 DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。
在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現一次，因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。

Appendix：cDNA接頭和引物

接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行：
接頭的5『端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點只有通過GSP的擴增之後才能夠產生。
這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外，它們允許從一個復雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的產物都有相同的末端結構，因為使用了單一的一套GSPs。

『捌』 race什麼意思

race 英[reɪs] 美[res]
n. 賽跑; 民世悉族; 人種; 競爭;
v. 參加比賽; 使比賽; 快速移動孫返搭; 劇烈跳動;
[例句]The women's race was won by the American, Patti Sue Plumer.
女子賽跑的冠軍被美國人帕蒂·休·普盧默奪得。
[其他] 第三人稱單數：races 復數：races 現在分詞：racing 過去式：raced過去分詞：則拿raced

『玖』 競走起源於哪個國家

競走（Race Walking）在旅行走路的基礎上發展起來，是兩腿交互邁步前進，與地面保持不間斷的接觸，山扒宏在任何時間都不得兩腳同時離地的田徑運動項目。
競走運動起源於英此宏國。19世紀末，歐洲盛行從一個城市到另一個城市的城市間競走活動，不久又從歐洲傳到北美洲、大洋洲，以及其他地區的許多國家。初期，競走採取普通走步或任意走的形式，對競走技術沒有嚴格的要求。1906年，國際奧委會會議首次將競走列為比賽項目，當時設有1500米和3000米兩個項目。從1956年奧運會開始，設20公里競走和50公里競走兩個男子比賽項目。1992年，巴塞羅那奧運會將女子10公里競走列入正式比賽項目。
世界競走運動的最高組織機構是1912年成立的世界田徑，該組織機構的主要職責是在全球開展田徑運動，制定田徑比賽的計時方法及建立世界紀錄的標准等。
比賽規則：
（1）競走比賽的兩個核心規則：①競走運動員逗冊必須始終保持至少有一隻腳與地面接觸；②前腿從著地的一瞬間起直到垂直位置，必須始終伸直，膝關節不能彎曲。
（2）比賽中有6-9名專職的競走裁判員監督運動員。按規則規定，他們不能藉助任何設備幫助判斷，只能依靠自己的眼睛來判斷運動員是否犯規。
（3）當競走裁判員看到競走運動員的動作有違反競走技術的跡象時，應予以黃牌警告，並在賽後報告給主裁判。
（4）當運動員的行進方式違反競走技術的規定，表現出肉眼可見的騰空或膝關節彎曲時，競走裁判員須將一張紅卡送交競走主裁判。
（5）當競走主裁判收到針對同一名運動員的三張來自不同競走裁判員的紅卡時，該運動員即被取消比賽資格，並由主裁判或主裁判助理向其出示紅牌。