⑴ 在植物學研究中使用分子標記應注意哪些問題
在植物學研究中使用分子標記應注意哪些問題
分子標記是以團棚羨個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用於標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學塌拍技術的發展，現在DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用於遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親和喚緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。
⑵ SSR分子標記是怎樣進行植物基因定位的
SSR分子標記是怎樣進行植物基因定位的
在真核生物的基因組中,每個SSR序列的基本單元重復次數在不同基因型間笑仿差頃嫌異很大,因此形成其座位的多態性,並且每個SSR座位兩端有一段保守的DNA序列,可以根據此保守序列設計引物,利用PCR技術進行擴增,然後用高濃度瓊脂糖凝膠或變性聚丙稀醯胺凝膠電泳進行分析.由於SSR多態性是由簡單序列重復次數的差異引起的,因此在擴增的PCR帶上會出現小片段或不連續的帶.由此可見,SSR分子標記的基本原理就是要了解SSR座位兩側的核苷酸序列,尋找其中雀升手的特異保護區.
⑶ 怎麼進行分子標記輔助育種
分子標記輔助育種(marker-aidedselection，MAS)常與基因工程育種並稱為「分子育種」(molecularbreeding)MAS主要用於四個方面，即替代病害鑒定加快回交育種減少有害基因連鎖和選擇抗病QTL使用分子標記可以大大加快常規育種過程常用的分子標記以及MAS在抗病種質資源方面的應用，已在本書第十四章作了詳細介紹
利用與抗病基因緊密連鎖的分子標記，可以准確地鑒選具有主效抗病基因的植株，代替病原菌接種鑒定有些病害，難以利用病原菌接種鑒定，其原因是多方面的，有的因病原菌缺乏匹配無毒基因，有的因病原菌是檢疫性有害生物而被限制使用，有的因接種鑒定受到環境條件或植物生育階段的限制而無法實行，還有的因抗病性表達不明顯不充分，難以得到明確結果在這些情況下，都可以利用分子標記鑒選抗病植株常規鑒定難以發現具有隱性抗病基因的個體，在涉及多個基因時，也難以由表現型判斷植株具有的基因種類和數目，而檢測團禪分子標記則易於做到使用共顯性分子標記，可以直接區別抗病基因的純合型和雜合型在累加或聚合多個抗病基因時，使用分子標記可以較容易而准確地檢出多基因累加系
利用分子標記選擇抗病單株可以在苗期或任何生育階段進行，只要植株可以提供檢測必需數量的DNA或蛋白質就可以進行，效率很高連鎖的分子標記可以通過多種分子檢測方法進行鑒定，應用PCR標記尤其經亮搭濟簡便使用分子標記篩選，代替傳統的費力費時的表現型篩選，可以節省50%~70%的時間但由於成本較高，分子標記篩選現在還難以取代常規鑒定，用於大育種群體鑒定結果仍需經常規接種鑒定核塌鍵塵實
⑷ 如何將分子標記應用於作物育種的抗病育種
利用多種分子標記技術可以定位與植物抗病或發育有關的基因，然後可以將基因克隆出來之後轉入對照植物，可以提高植物抗病抗逆或促進發育。
以分子標記技術在小麥條銹病抗病育種上的運用為例。
分子標記
在農業基礎與應用研究領域，分子標記技術已開始應用於作物種質資源和育種的研究，特別是在構建分子遺傳圖譜和標記目的性狀基因方面取得了很大的進展。
分子標記與形態標記、細胞標記、生化標記相比較，有以下幾方面的優點:①在植物體的多個組織及生育階段均可檢測到，不受時空限制。②數量多，遍及整個基因組。③有許多標記表現為共顯性，能夠鑒別基因型純合與否，提供完整的基因型。在標記小麥抗葉銹病基因方面，分子標記可以在更深層次上揭示小麥抗銹遺傳機制。通過找到與抗銹基因緊密連鎖的分子標記，不但能在遺傳背景不同的育種材料中特異性的檢測目的基因，而且可以鄭型在任一生育階段同時對多個抗性基因進行篩選，這為了解抗源和抗病品種中所含有的抗性基因提供了更為迅速、穩定、可靠的方法。
目前，用於標記小麥抗葉銹病基因的分子標記主要有以下幾種:
2.l RFLP技術在小麥抗葉銹病基因標記中的應用
RFLP(restriction fragment length polymorphism)作為遺傳分析的工具開始於1974年，80年代開始應用於植物。其基本原理是物種的基因組DNA在限制性內切酶的作用下，產生相當多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素標記的DNA做探針把與被標記DNA相關的片段檢測出來，從而構建出多態性圖譜;它所代表的是基因組 DNA在限制性內切酶消化後產生的片段在長度上的差異。RFLP技術被廣泛應用於小麥遺傳圖譜的構建標記和定位小麥的目的基因。
在小麥抗葉銹病基因的RFLP標記方面，SCHACHERMAYR等[8]將一編碼受體蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段做寬用 PstⅠ分成六個亞片段，將這些亞片段作為RFLP標記，尋找到了特異的Lrk10片段可作為與小麥抗葉銹病基因Lr10緊密連鎖的分子標記，將這一亞片段與已知抗性基因的單基因系進行Southern雜交，發現這一3.9Kb的HindⅢ片段僅存在於攜帶抗葉銹病基因Lr10的近等基因系中。進一步將此 RFLP標記Krkl0-6轉變為STS標記STSLrkl0一6，發現一282bp的片純叢亮段僅存在於攜帶Lr10的品種中，F2群體分離進一步證明此 282bp的片段與Lr10緊密連鎖。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了與抗葉銹病基因Lr24緊密連鎖的RFLP和RAPD的標記。在供試的115個RFLP探針中，其中6個與Lr24緊密連鎖，從360個隨機RAPD引物中，找到了11個能夠揭示多態性的引物，其中一個與 Lr24緊密連鎖，並將該RAPD產物克隆、測序將其轉化為更為穩定可靠的STS標記，為分子標記輔助育種打下了良好的基礎。FEUILLET等[10] 利用小麥抗葉銹病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品種Frisal，通過F2群體分離，將37個RFLP中的16個定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之間揭示多態性，I1個RFLP探針能在近等基因系間揭示多態性，F2群體分離分析發現，其中3個與抗性基因連鎖，其中一定位在染色體5D上的探針pTAG621證明與Lr1緊密連鎖，並將這一RFLP標記轉化為了更為可靠的STS 標記。
AUTRIQUE[11]等利用4種含不同抗性基因的小麥近等基因系，根據抗性基因在其染色體上所處的位置選擇克隆，同時，從大麥的RFLP連鎖圖譜和D一基因組RFLP圖譜中，挑選了其它的克隆。通過雜交的方法來尋找多態性分子標記。結果發現，定位在染色體7DL和3DL上的8個分子標記，與抗性基因Lr19和Lr24共分離;來自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色體6B上，一克隆XksuD27與Lr9共分離，以及與Lr32緊密連鎖的兩個RFLP標記，遺傳距離分別為(3.3土2.6)cM和(6.9土3.6)cM。
2.2 小麥抗葉銹病基因的RAPD標記
NAIK等[12]利用含Lr28的抗葉銹病近等基因系，從80個隨機引物中找到了一個能在供體親本和輪回親本中揭示多態性的RAPD標記OPJ一 O1。將此387bp的多態性產物克隆、測序，將其設計成更為穩定的STS標記，利用BSA法，對F3群體進行分析，發現387bp的特異性產物只出現在抗性群體中，而在感病群體中表現缺失。證明了RAPD標記OPJ一O1和STS 標記均與Lr28緊密連鎖。SIELDLER等[13]利用400個隨機引物和14個DNA探針篩選近等基因系Lr9的多態性，並通過F2群體進行遺傳連鎖分析。結果表明2個RAPD標記和一個RFLP標記可以區分抗感品系,且與Lr9緊密連鎖。WILLIAM等[14]利用RAPD技術，從400個隨機引物中，找到了3個能在抗病群體和感病群體中揭示多態性的引物0PG-05、0P1-16和OPR-03，將其克隆轉化成探針後，對重組群體進行 Southern雜交，確定其中前兩個探針與持久抗葉銹病基因相關的數量性狀位點(QTL)緊密連鎖，其中定位在7BL上的QTL與抗葉銹病基因Lr34 部分同源。SCHACHERMAYR等[15]從395個隨機引物中篩選出了3個與小麥抗葉銹病基因Lr9連鎖的RAPD標記，將其特異性產物克隆、測序，然後轉化成更為穩定的STS標記，F2、F3分離群體檢測發現，所有的3個RAPD標記0PA-07、0PJ-l3、OPR-15和一RFLP標記 cMWG684與Lr9緊密連鎖。另一RFLP標記PSR546也與Lr9緊密連鎖，並與上述四個
DNA標記緊密連鎖，遺傳距離為(8士2.4)cM，此標記被定位在小麥染色體長臂6BL上。DEDRYVER等[16]利用含Lr24的小麥抗葉銹病近等基因系，在125個隨機引物中，只有引物OP-H5能在抗病親本RL6064中擴
增出一700bp的特異性的條帶，而在感病親本Thatcher中沒有。F2群體分離證明，該標記與Lr24完全連鎖。將其轉變成穩定、可靠的SCAR標記，為分子標記輔助育種提供了有力的工具。
3 其它分子標記
雖然RFLP和RAPD是兩種比較普遍的分子標記，但RFLP在小麥中檢測的多態性較低，僅為20%--38%。RAPD是方便經濟的分子標記，但是重復性和穩定性較差。其它的分子標記，如SSR、ISSR和AFLP的綜合信息量大，在作物特別是小麥遺傳資源的研究上有著廣闊的應用前景。
4 分子標記輔助選擇
目前，分子標記技術已開始應用於育種實踐，並表現出其獨特的優越性。尋找與重要的農藝性狀緊密連鎖的分子標記，是進行分子標記輔助選擇(又稱分子育種)和通過作圖克隆基因的基礎。分子標記輔助選擇(Molecular-assisted-selection簡稱MAS)是生物技術與傳統遺傳育種相結合而形成的，它可以減少傳統的回交育種過程中很難消除的連鎖累贅，還可以把不同抗葉銹病基因聚合到同一優良品種中，實現同效基因的累加作用，獲得持久抗性。在獲得穩定的分子標記的基礎上，通過染色體步行(Chromosome walking)等方法分離克隆該基因。
由於分子標記育種技術目前尚不成熟和完善，因此還不能作為一種育種方法單獨使用。我國傳統育種經驗豐富，因此，應注意將分子標記這一先進技術與育種家的豐富經驗相結合，使分子標記輔助選擇發揮其更大的作用。
⑸ 植物分子系統學研究的常用技術和方法有哪些
網上找到的
常用技術方法
(一)同位素標記法
同位素用於追蹤物質的運行和變化規律。用示蹤元素標記的化合物，化學性質不會改春遲唯變。人們可以根據這種化合物的放射性，對有關的一系列化學反應進行追蹤。這種科學研究方法叫做同位素標記法，也叫同位素示蹤法。
可用於研究旦皮細胞內的元素或化合物的來源、組成、分布和去向等，進而了解細胞的結構和功能、化學物質的變化、反應機理等。如3H、14C、15N、18O、32P、35S等。
1. 科學家利用「同位素標記法」弄清了許多化學反應的詳細過程．下列說法正確的是
A．用14C標記扒培CO2最終探明了CO2中碳元素在光合作用中的轉移途徑
B．用18O標記H2O和CO2有力地證明了CO2是光合作用的原料
C．用15N標記核苷酸弄清了分裂期染色體形態和數目的變化規律
D．用35S標記噬菌體的DNA並以此侵染細菌證明了DNA是遺傳物質 A
（二）熒游標記法。
同位素標記法和熒游標記法的區別：同位素標記法通常採用放射性同位素標記物質中的分子原子，熒游標記法通常是藉助熒光分子來標記蛋白質。一個是元素標記，另一個是分子標記。
2.現代分子生物學採用的測定基因在染色體上位置的方法是
A.雜交法 B.測交法 C.熒游標記法 D.X射線衍射法 C
（三）差速離心法
用高速離心機在不同的轉速下進行離心，利用不同的離心速度所產生的不同離心力，就能將各種細胞細胞分開
（四）分子雜交技術：
根據某些物質分子之間特異性識別和結合的性質，利用已有的物質分子對未知物質分子進行檢測的技術。
3. 用某人的胰島素基因製成的DNA探針，檢測下列物質，不能形成雜交分子的是，
A．該人胰島A細胞中的DNA B．該人胰島B細胞的Mrna C．該人胰島A細胞的mRNA D．該人肝細胞的DNA C
二．科學研究方法
（一）類比推理
根據兩個對象之間有某些性質相同，從而推測它們的其他性質也相同的方法。應當注意的是，類比推理的結論具有偶然性，可能是正確的，也可能是錯誤的，其證實或證偽還需要通過觀察或實驗。
⑹ 分子標記在辣椒種質資源研究上的應用是怎樣的
「七五」以來，中國辣椒常規育種特別是雜種優勢利用取得了很大的成功，中椒、湘研、蘇椒和甜雜等系列F1代已成為商品椒生產的主栽品種。然而，和其他作物育種一樣，目前辣椒育種的瓶頸是育種材料狹窄的遺傳背景。辣椒有豐富的遺傳資源，但被育種家利用的材料只是極少數。中國對辣椒種質資源的研究大多限於植物學性狀和園藝性狀的觀察，沒有系統地對這些種質資源進行鑒定和分類，更沒有有效地利用野生、半野生種質資源的有益基因對現有自交系進行改良或創新。分子標記是20世紀80年代發展起來的遺傳分析技術，目前在美、法、以、韓等國已經被廣泛用於辣椒種質資源的分類和鑒定。許多重要質量性狀的分子標記輔助育種已經達到應用階段。分子標記連鎖遺傳圖譜為復雜的數量性狀的改良和創新提供了藍圖。
一、種質資源的鑒定和分李談扮類
用分子標記技術可以快速構建種質資源的指紋圖譜，為種質資源的鑒定和分類、優異種質資源的知識產權保護、核心種質庫的構建提供更加客觀的依據。
（一）辣椒屬Capsicum frutescens和C.chinense的鑒定
Capsicum frutescens和C.chinense形態相似。在辣椒屬分類學中一個長期的爭論是：C. frutescens和C.chinense究竟是兩個不同的物種還是同一個種里的兩個不同類型。通過RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA）標記分析，美國新墨西哥州立大學的研究者發現C.frutescens的品系間平均遺傳相似系數為0.85，C.chinense的品系間平均遺傳相似系數為0.80，而C. frutescens和C.chinense的平均遺傳相似系數僅為0.38（Bl and Bosland，2004）。根據這一有力的證據，並結合兩者形態學性狀的差異及雜交後代的育性降低等事實，他們認定C. frutescens和C.chinense是辣椒屬里兩個不同的物種。
（二）栽培辣椒起源中心和次生中心的遺傳多樣性比較
栽培辣椒（C.annuum var.annuum）起源於墨西哥，15世紀被航海家哥倫布帶到歐洲，後來傳到亞洲和非洲。亞洲、中南歐和非洲被認為是辣椒的次生中心。辣椒在尼泊爾被廣泛栽培，當地農民保存了數量繁多的地方品系。RAPD標記聚類分析表明在遺傳相似系數設定為0.80時，所有尼泊爾的地方品系均分在同一組，而墨西哥的品系則可以分為8個不同的組（Bl and Bosland，2002）。這表明由於洲際遷移，尼泊爾的辣椒群體經過了一個進化的瓶頸而具有很窄的遺傳背景。中國湖南、雲南、四川和陝西等省也有很多地方品系侍脊，是中國辣椒育種的主要遺傳材料。尼泊爾的案例應該對中國辣椒種質資源研究有啟發作用，即在採集具有中國特色辣椒種質資源的同時，應該更重視辣椒起源中心墨西哥種質資源的收集，因為起源中心有更為豐富的基因庫。
二、辣椒分子標記遺傳圖譜
遺傳圖譜是遺傳育種研究的基礎工具，是挖掘種質資源中有益基因特別是數量性狀基因的藍圖。在分子標記誕生以前，只有玉米和番茄等極少數作物有較完備的遺傳圖譜。分子標記的誕生為遺傳圖譜的構建提供了極大的方便。辣椒分子遺傳圖譜的建立得益於其和番茄這一模式作物的親源性。番茄—辣椒的比較遺傳學研究表明：雖然辣椒的基因組進化經歷了較大的重組，導致辣椒的基因組比番茄大3～4倍且基因的排列順序差別很大，這兩種茄科作物卻有極其相似的基因內容。所有測試過的番茄cDNA探針都能與辣椒基因組DNA雜交（Tanksley et al.，1988）。應用這些探針的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長度多態性）標記構成了辣椒分子遺傳圖譜的骨架。到目前為止研究者已經發表了10幅辣椒分子遺傳圖譜，但最具代表性的是美國康乃爾大學和法國農業科學院發表的兩幅圖譜。
康乃爾大學圖譜（CU-Map）所用的群體是C.annuum×C.chinense的種間雜交F2代群體。此哪灶圖譜包括11個大連鎖群（76.2～192.3cM）和2個小連鎖群（19.1和12.5cM），總共覆蓋1245.7cM的基因組。Jahn博士領導的辣椒遺傳育種實驗室利用來自於番茄的RFLP標記探針對番茄和辣椒的基因組作了系統的比較遺傳學研究。結果表明兩者之間有18個同源連鎖片段，涵蓋了番茄基因組的98.1%和辣椒基因組的95%。通過這幅圖譜以及馬鈴薯的圖譜，他們確定了造成這3個重要茄科作物進化史上分化的染色體重組的類型和次數，並重建了這3者共同祖先的理論圖譜。這些染色體重組包括5次易位、10次臂內倒位、2次臂間倒位以及4次染色體的分離/締合。在作圖群體的兩個親本之間也存在3次染色體重組。CU-MAP共標定了677個包括RFLP，RAPD，AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性）以及同工酶標記，平均每1.8cM就有1個標記。但是由於標記在染色體上的分布不是均勻的，54%的標記集中在著絲點附近，使得CU-MAP的骨架圖譜的標記密度是9cM/標記（Livingstone et al.，1999）。對於辣椒來說這種標記密度已經是理想的了。
法國農業科學院圖譜（INRA-MAP）所用的3個群體都是C.annuum種內雜交群體，其中有兩個DH（Doubled Haploid，加倍單倍體）群體（HV-H3×Vania和PY-Perennial×Yolo Wonder）和一個F2群體（YC-Yolo Wonder×Criollo de Morelos 334）。因為常規育種所應用的種質資源主要來源於C.annuum，種內雜交圖譜能更好地用於分析育種實際使用的基因庫，能直接提供分子標記為育種服務。例如，這3個群體都有一個親本對CMV和疫病有部分抗性，而另外一個親本則對這兩種重要病害高感。HV和PY是DH群體，屬於永久群體，可以多次重復多年多點觀察各種數量性狀的遺傳。以Palloix博士為首的法國農業科學院辣椒育種小組也准備將YC群體轉化為永久性的RIL（Recombinant Inbred Lines，重組自交系即單粒傳後代）群體，以便於研究疫病抗性這一重要的數量性狀（Palloix，個人通訊）。共有543、630和208個標記位點（包括RFLP，RAPD，AFLP，PCR，同工酶及形態學標記）被標定在HV、PY和YC圖譜上。通過整合這3幅圖譜，他們繪出了含有12個大連鎖群的整合圖譜，和辣椒單倍體的染色體數目相吻合，並和CU-MAP的研究結果相似，這個整合圖譜和番茄圖譜之間相互關系非常復雜（Lefebvre et al.，2002）。
一批控制園藝性狀的基因或數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL），如抗病性、熟性、雄不育、辣味、果色、果重和果形指數等，已經被定位在分子標記遺傳圖譜上（表26-1）。這為通過分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）對多個性狀進行種質資源的改良和創新提供了條件。
表26-1 辣椒已定位的基因或數量性狀位點
表26-1 辣椒已定位的基因或數量性狀位點（續）-1
三、種質資源改良和創新中的分子輔助篩選
對種質資源中有益基因的利用存在新舊兩種模式：表型選擇法和基因選擇法（Tanksley and McCouch，1997）。表型選擇法對於有單基因控制性狀的育種是成功的，如辣椒抗根結線蟲育種等。但是由於受性狀鑒定的條件限制，表型選擇法只能操作數量有限的基因。對於辣椒的大部分重要數量性園藝性狀，如產量、抗CMV、抗疫病、果實性狀等，表型選擇法有很大的局限性，會漏掉很多有利的基因。基因選擇法可以同時選擇多個基因位點，可以在苗期進行選擇，提高種質資源改良和創新（特別是遺傳復雜的數量性狀的改良）的效率和針對性。基因選擇法需有兩個前提條件：一是覆蓋度高、密度較高的分子標記遺傳圖譜；二是標定在此圖譜上的需選擇的基因和數量性狀位點。下面通過3個例子說明基因選擇法在種質資源改良和創新上的應用。
（一）核質互作雄性不育恢復基因
辣椒質核互作不育（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）可以提高雜交制種的效率和純度，在生產上很有前途。CMS中育性恢復由主效和微效基因共同控制，且受到環境條件如溫度的影響。恢復系在辣椒中可以找到，但在大果形甜椒中則沒有。在向大果形甜椒中轉育恢復基因的過程中，需要通過和不育系測交才能確定恢復基因的存在。研究表明通過表型選擇法來創造大果形甜椒恢復系非常困難。中國農業科學院蔬菜花卉所辣椒育種組利用21號牛角椒（rfrf）和湘潭晚（RfRf）的F2群體篩選了和主效恢復基因Rf連鎖的分子標記（Zhang et al.，2000）。兩個RAPD標記和Rf連鎖：OP131400離這一主效基因僅0.34cM；OW19800位於Rf的另一側，遺傳距離為8.12cM。供試的甜椒品種均沒有這兩個標記，這兩個標記可以用於將辣椒的主效育性恢復基因轉移到甜椒中去。
和法國農業科學院合作，該課題組將育性恢復作為數量性狀定位在以Perennial（RfRf）×Yolo Wonder（rfrf）雙單倍體群體構建的分子標記遺傳圖譜上（Wang et al.，2004）。主效恢復基因被定位在辣椒6號染色體上，並定位了4個微效基因。其中一個微效基因被定位在2號染色體上，並和控制辣味的基因（Pun1）緊密連鎖，這解釋了為什麼辣椒品系恢復系頻率更高。同時發現保持系Yolo Wonder也有可提高育性恢復的微效基因，這表明育性恢復有超親優勢。這些結果對於創造高不育度的不育系和高恢復度的恢復系有很大的指導意義。
（二）抗黃瓜花葉病毒（CMV）
CMV在辣椒上能產生嚴重的花葉症狀、導致葉片變形扭曲和並能損害果實的商品性狀，是辣椒最嚴重的病害之一。CMV抗性是典型的數量性狀，至今沒有發現一份材料對CMV有完全的抗性。但部分抗性在栽培辣椒的野生品系和近緣野生種中時有發現。這些材料對CMV的抗性或耐性機制主要有3種：①抑制病毒侵入寄主細胞；②抑制病毒的繁殖；③抑制病毒的移動。另外中國CMV抗源材料二斧頭中還有另外一種CMV耐性機制，即感病後能夠恢復（Palloix，個人通訊）。把控制這些抗性機制的基因通過育種疊加在一起是獲得高抗品種的必然途徑。
Cnta等將Perennial上的抑制病毒侵入的QTL定位在3號和12號染色體上。8號染色體的TG66位點本身不提供抗性，但和12號染色體上的QTL有上位互作。這3個位點共解釋57%的表型變異（Cnta et al.，1997）。甜椒自交系Vania能部分地抑制病毒的長距離移動，這種抗性主要由12號染色體上的主效QTL-cmv12.1提供。取決於表型鑒定的方法，該QTL解釋45%～63.6%的表型變異（Cnta et al.，2002；Parrella et al.，2002）。Palloix等觀察到，Vania抵抗病毒侵入的能力很低，但卻有較高的抑制病毒移動的能力；而Perennial正好相反。育種結果表明綜合這兩種不同抗病機制的QTL的材料有很大的超親優勢（Palloix，個人通訊）。
Ben Chaim等將Perennial中另一個抗CMV的QTL-cmv11.1定位在第11號染色體上。該QTL和抗TMV基因L連鎖，但處於排斥相，這解釋了在Perennial中CMV抗病性和TMV感病性是相關的。Perennial上，其3、4、8號染色體上的抗CMV的QTL和控制果重的QTL fw3.2、fw4.1及fw8.1連鎖。這樣在回交過程中，Perennial的小果重QTL就會隨著抗CMV的QTL一起被導入到輪回親本中（Ben Chaim et al.，2001）。要打破這種連鎖累贅，必須用分子標記精確地定位這些緊密連鎖的QTL並在較大的回交群體中篩選重組植株。
（三）抗疫病
疫病是辣椒最嚴重的土傳病害，目前國際辣椒育種界公認抗病性最強的材料是來自於墨西哥的小果形地方品種Criollo de Morelos 334（CM334）。法國農業科學院Palloix小組對這份抗源作了細致的研究，確定了6個QTL：Phyto.4.1、Phyto.5.1、Phyto.5.2、Phyto.6.1、Phyto.11.1和Phyto.12.1（Thabuis et al.，2003；2004）。其中Phyto.5.1和Phyto.5.2也存在於其他辣椒品系中如Perennial和H3等。Phyto5.2現在可以通過一個緊密連鎖的PCR標記D04來輔助選擇（Quirin et al.，2005）。
CM334現已被各國育種研究機構和種子公司廣泛用於抗疫病種質資源的改良或商業育種。Thabuis等人（2004）利用分子標記比較了不同輪回育種方案在轉育CM334抗病性時的效率，發現在高選擇壓力時的抗病QTL不易丟掉。經過多年的努力，Palloix小組已經育成了疫病抗性較強的優異甜椒品種（個人通訊）。這些材料的引進為快速提高中國抗疫病育種的水平提供了機會。
在「七五」至「九五」期間的快速發展以後，中國辣椒育種目前又面臨新的瓶頸。這主要是由於辣椒種質資源的收集、鑒定、改良和創新的力度不夠，導致育種研究後繼乏力。由於辣椒轉基因很困難，這使得分子標記輔助育種成為提高育種效率的重要生物技術手段。然而除了核質互作雄不育恢復以外，分子標記技術尚未在中國辣椒遺傳研究中發揮其作用。為了加強分子標記技術在辣椒育種和種質資源利用上的研究，人們仍然有很多基礎工作要做，包括通過分子標記建立中國辣椒核心種質資源庫、建立分子標記遺傳圖譜、重要性狀的分子遺傳機理研究、分子標記輔助育種的實用化等。這些工作的實施，需要借鑒美、法、以等國先進的研究成果，需要密切關注其他茄科作物如番茄、馬鈴薯和煙草基因組學的最新進展，更需要國內從事辣椒種質資源研究、分子生物學研究和育種研究單位的通力合作以及可共享的創新研究體系的建立。
⑺ 西瓜的分子標記技術是怎樣的
近年來，隨著分子生物學的發展，直接在DNA水平上進行基因組差異分析的技術（RAPD、RFLP等）越來越受到重視。與蛋白質和同工酶分析相比，DNA分析的方法更能直接反映出研究對象的遺傳信息，准確率高，穩定性好，目前，已廣泛用於西瓜遺傳基礎的研究。
（一）遺傳圖譜的構建
Hashizume等（1996）利用一個近交系（H-7；C.lanatus）和一個野生類型（SA-1；C.lanatus）雜交獲得的BC1群體構建了一個最初的西瓜分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜包括58個RAPD標記，1個同工酶標記，1個RFLP標記和2個形態標記，分為11個連鎖群，全長524cM。張仁兵等（2000）利用97103×PI296341雜交的F2群體構建了一個分子遺傳圖譜，包括85個RAPD標記，3個SSR標記，3個同工酶標記，4個形態標記及1個抗枯萎病生理小種1基因，覆蓋基因組長度為1203.2cM。Hawkins等（2001）利用F2和F3群體構建了兩張西瓜連鎖圖譜，分別包括26和13個標記（同工酶、RAPD、SSR），分布在2個和5個連鎖畢余群上、覆蓋基因組長度分別為112.9cM和139cM。Levi等（2001）利用BC1群體[（PI296341-FR×NKM）×NKM（New Hampshire Midget）]構建了長達1295cM的遺傳連鎖圖譜，包括155個RAPD標記和1個SCAR標記，分為17個連鎖群，而後Levi等又利用一個測交群體構建了包括141個RAPD標記、27個ISSR標記和1個SCAR標記的分子遺傳圖譜，分為25個連鎖群，全長1162.2cM。范敏等（2000）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜種質PI296341雜交所得F2的118個單株為作圖群體，構建分子連鎖圖譜，定位了影響西瓜果實可溶性固形物含量的4個數量性狀位點（QTL），果皮硬度的5個QTL，果皮厚度的2個QTL，單瓜重的3個位點，種子千粒重的6個位點。
然而，利用BC1或F2等非永久群體所構建的分子遺傳圖譜，無法繼續將其飽和，難以准確地對其進行重要農藝性狀的QTL定位，同時也無法與其他實驗室合作進行比較研究。因此，採用永久群體如重組自交系與DH（單倍體加倍）群體進行分子遺傳圖譜的構建已經成為目前國際上圖譜構建的主流方向。由於西瓜花葯與小孢子培養比較困難，利用重組自交系來構建西瓜永久分子遺傳圖譜可能成為最有效的選擇。張仁兵等（2003）用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜種質PI296341雜交所得重組自交系F8的117個單株為作圖群體，利用RAPD標記技術構建了西瓜分子遺傳圖譜。該圖譜包含87個RAPD標記、13個ISSR標記和4個SCAR標記，分為15個連鎖群，包括：1個最大的含31個標記的連鎖群（277.5cM）、6個大的含4～12個標記的連鎖群（51.7～172.2cM）和8個小的含2～5個標記的連鎖群（7.9～46.4cM），覆蓋基因組長度為1027.5cM，兩個標記間的平均距離斗啟為11.54cM。該圖譜為以後獲得飽和的分子遺傳圖譜、重要農藝性狀的QTL分析以及圖譜克隆抗病基因奠定了堅實的基礎。
西瓜是一種基因組小（約為4.3×105kb）、遺傳差異狹窄的作物，以上分子標記主要是採用多態性較低、穩定性較差的RAPD標記，不能滿足其分子遺傳研究的需要。易克（2003）對97103×PI296341所獲得的F8重組自交系群體，通過16個SSR和5個ISSR引物對該群體進行擴增，建立了一個包括38個SSR標記和10個ISSR標記組成的分子圖譜，該圖譜總長558.1cM，平均圖距為11.9cM。易克（2004）又對97103×PI296341所獲得的F2S7重組自交系群體，通過AFLP技術對該群體進行擴增，建立了一個包括150個標記組成的分子圖譜，包括17個連鎖群，覆蓋基因組范圍1240.2cM，兩個標記間的平均圖距為8.3cM。該圖譜的建立對於西瓜高密度遺傳圖譜的構建、重要農藝性狀的QTL定位以及重要基因的圖譜克隆均具有重要的參考價值。
（二）遺傳多樣性及親緣關系分析
西瓜的遺傳背景相對狹窄，栽培種和野生種、種間多態性較高，品空數如種之間多態性較低。Zhang XP等（1994）對3份栽培品種、1份栽培種的野生類型材料和1份栽培種與野生種的雜交種進行RAPD檢測，53個引物在5份材料中產生的多態性為62.3%，而在3個栽培品種內的多態性帶僅為10.1%，其平均遺傳距離為0.240～0.263cM。韓國的Lee SL等（1996）對39份西瓜材料進行RAPD檢測與聚類分析，發現其平均遺傳距離的變動范圍僅為0～0.366。趙虎基等（1999）對西瓜的RAPD標記多態性研究表明：14個引物在12份材料間共擴增出114條帶，其中有81條具多態性，占總條帶的71.1%。其中一份飼用西瓜、3份食用西瓜和8份籽用西瓜之間帶型差異較大，說明親緣較遠；8個籽瓜之間和3個食用西瓜之間帶型差異較小，說明親緣較近。
李嚴等（2005）利用SRAP（Sequence-Related Amplified Po1ymorphism）進行了西瓜雜交種遺傳多態性的研究，利用25個多態性引物組合對當前生產上推廣的20個西瓜雜交種進行擴增，從中篩選得到20個多態性引物組合，共產生135個多態性條帶，平均每個引物組合產生7.11個多態性條帶，顯示了較高的多態性。聚類分析將20份材料分為3大類，Jaccard』s相似系數在0.29～0.86之間。
（三）雜種鑒定
歐陽新星等（1999）採用簡化了的適合西瓜的RAPD-PCR分析程序，對無籽京欣1號西瓜種子純度進行分子鑒定，找到了一個標記OPP01/564，其只在父本和雜交種上出現，母本中不出現，可用於鑒定該雜交種的品種純度。
王鳴剛等（2003）以不同西瓜雜交種及親本自交系為材料，研究利用RAPD技術鑒定西瓜雜種的純度及種質的方法。結果表明：RAPD技術完全適合於西瓜雜交種純度的早期鑒定及種質鑒定。引物OPD16及OPA07適合種內鑒定，而引物OPA10、OPA13、OPH18可用於雜種純度鑒定。其中，引物OPA10/890（母本缺少）和OPA13/1140（母本缺少）、OPA13/750（父本缺少）可用來鑒定西農8號西瓜雜交種純度；母本缺少的引物OPH03/350，OPH04/280和OPH18/620能用來鑒定蘭州P2的雜交種純度。
（四）分子標記輔助選擇
許勇等（1998）運用RAPD技術進行了西瓜野生材料PI482322耐冷性基因的分子標記研究，找到了一個與耐冷基因連鎖的分子標記OPG12/1950，其遺傳距離為6.98cM。許勇等（1999）運用RAPD技術，採用混合分組分析（BSA）方法進行了西瓜野生種質PI296341抗枯萎病基因分子標記研究。結果表明：西瓜野生種質PI296341對枯萎病生理小種1的抗性由單顯性基因控制，RAPD標記OPP01/700與其抗病基因連鎖，其遺傳距離為3.0cM。許勇等（2000）對RAPD標記OPP01/700進行了克隆、測序，Southern雜交證明此標記為單拷貝，並轉化為SCAR標記。上述技術在抗病轉育後代中得到了很好的應用，初步建立了西瓜抗枯萎病育種分子標記輔助選擇系統。
劉海河等（2004）利用RAPD技術對西瓜G17AB雄性不育系的不育株和可育株基因組DNA進行了比較分析，在31套621個RAPD引物中，有548個引物在兩者之間獲得擴增產物，篩選到了可育株與不育株的特異擴增條帶A123K（分子量約為3.0kb，序列為5』-TCGGCGATAG-3』）片段，經多次重復驗證，表現穩定的多態性。用該引物對單個不育株後代育性分離群體進行了RAPD分析，確定了A123K與育性基因的遺傳距離為8.1cM。
張顯等（2005）應用RAPD分子標記技術，採用BSA法對西瓜隱性核不育材料Se18的不育基因進行了分子標記研究。結果表明：在220個引物中，只有引物S1167（序列為ACCACCCGCT）、S357（序列為ACGCCAGTTC）在不育株DNA中擴增出了多態性特異片段，而在可育株DNA中未擴增出多態性片段。驗證結果表明：引物S1167在12個不育材料中的138個不育株全部擴增出特異性片段，可以區分不育株與可育株。對特異性片段進行回收、克隆和測序結果表明，S1167擴增特異片段有2391個鹼基對。