免疫組化技術如何運用

Ⅰ PCR技術與免疫組化技術的實際應用中的異同點

免疫組織化學（Immunohistochemistry）又稱免疫細胞化學。它是組織化學的分支，它是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內抗原（或抗體）的分布進行組織和細胞原位檢測技術。

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增。

Ⅱ 免疫組化怎樣做

你是病理技術員嗎？這個需要去進修的，不然不要嘗試，浪費試劑不說，准確度堪憂

Ⅲ 免疫組化的操作步驟

1. 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行

2.緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

(注:孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清，這一步可以省略。)

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育1 - 2 小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定)

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增強子)，在室溫下孵育 20 分鍾。

10 .緩沖液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶標二抗) ，在室溫下孵育 30 分鍾。

(注:HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。)

12 .緩沖液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen)，混勻後滴加到切片上，孵育 3 - 15 分鍾。(具體時間由染色深淺決定。)

14 .自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

Ⅳ 免疫組化技術的介紹

免疫組織化學（Immunohistochemistry）又稱免疫細胞化學。它是組織化學的分支，它是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內抗原（或抗體）的分布進行組織和細胞原位檢測技術。

Ⅳ 免疫組化的用途，求專業人士解答。

由於免疫組化具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點，且能將形態研究與功能研究有機地結合在一起，所以，這門新技術已被廣泛地應用於生物學和醫學研究的許多領域。在病理學研究中，免疫組化技術的作用和意義更為重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術出現以前，對腫瘤的診斷和分類還局限於細胞水平，而引入免疫組化技術後，則使研究的深度提高到了生物化學水

由於免疫組化具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點，且能將形態研究與功能研究有機地結合在一起，所以，這門新技術已被廣泛地應用於生物學和醫學研究的許多領域。在病理學研究中，免疫組化技術的作用和意義更為重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術出現以前，對腫瘤的診斷和分類還局限於細胞水平，而引入免疫組化技術後，則使研究的深度提高到了生物化學水平、分子水平。近年來，伴隨基因探針研究而興起的核酸分子原位雜交技術也正在蓬勃發展，更使免疫組化如虎添翼，兩者相得益彰，將研究推進到了基因水平。

1、確定細胞類型

通過特定抗體標記出細胞內相應抗原成分，以確定細胞類型。如角蛋白是上皮性標記，前列腺特異性抗原僅見於前列腺上皮，甲狀腺球蛋白抗體是甲狀腺濾泡型癌的敏感標記，而降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌的特有標記。有些細胞(如表皮內朗格漢斯細胞、黑色素細胞、淋巴結內指突狀和樹突狀網織細胞)光鏡下不易辨認，但免疫組化標記(S-100蛋白等)能清楚顯示其形態。

2、辨認細胞產物

利用某些細胞產物為抗原制備的抗體，可作為相應產物的特殊標記，如內分泌細胞產生的各種激素，大多數可用免疫組化技術標記出來，據此可對內分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等。

3、了解分化程度

大多數標記物都有其特定的分布部位，如上皮細胞膜抗原(EMA)著色部位在細胞膜上，但差分化乳癌胞漿內也可出現陽性顆粒;角蛋白的含量也與分化程度有關，低分化或未分化癌含量較低、染色較弱。

4、鑒定病變性質

通過標記Ig輕鏈(κ、λ)可區分部分B細胞性淋巴瘤與B細胞反應性增生，前者常表達單一的Ig輕鏈(κ+/λ+)，後者常為多克隆Ig輕鏈(κ+、λ+)。而標記Bcl-2蛋白在區別濾泡型淋巴瘤和反應性濾泡增生上有相當的意義。在濾泡型淋巴瘤，90%以上腫瘤性濾泡細胞有bcl-2的高表達;而在濾泡反應性增生時，濾泡反應中心的細胞不表達Bcl-2蛋白，而套細胞則表達。

5、發現微小轉移灶

某些癌的早期轉移有時與淋巴結內竇性組織細胞增生不易區別。用常規病理組織學方法要在一個組織中認出單個轉移性腫瘤細胞或幾個細胞是不可能的，而採用免疫組化方法(如用上皮性標志)則十分有助於微小(癌)轉移灶的發現。對轉移性腫瘤也可藉助免疫組化標志尋找原發瘤，如骨組織內有前列腺特異性抗原陽性細胞，提示前列腺癌轉移。

6、探討腫瘤起源或分化表型

一些來源不明的腫瘤長期爭論不休，最後通過免疫組化標記取得共識。如顆粒性肌母細胞瘤，曾被認為是肌源性的，但該腫瘤肌源性標記陰性，而神經性標記陽性，證明為神經來源(可能來自神經鞘細胞)。分化很差的腫瘤病理上常按細胞形態分為梭形細胞腫瘤、小圓細胞腫瘤等，通過多種標記的聯合應用，也可能確定來源。

7、確定腫瘤分期

判斷腫瘤是原位還是浸潤及有無血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關。用常規病理方法判斷有時是十分困難的，但用免疫組化法可獲得明確結果。如採用層粘連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可清楚顯示基底膜的主要成分，一旦證實上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤癌了，其預後是不同的。用第八因子相關蛋白、荊豆凝集素等顯示血管和淋巴管內皮細胞的標記物則可清楚顯示腫瘤對血管或淋巴管的浸潤。對許多腫瘤的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，這是主要的鑒別依據，同時也有治療及預後意義。

8、指導治療和預後

免疫組化標記中與預後有關的標記大致可分為三類：①類固醇激素受體：如雌激素受體、孕激素受體等，它們與乳腺癌的關系已獲公認，性激素受體陽性者內分泌治療效果較好，預後也較好。相似的結果也見於子宮內膜癌和卵巢癌。②腫瘤基因標記：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在腫瘤中高度表達者，患者預後較差;而nm23蛋白高度表達者，腫瘤轉移率較低，預後較好。③細胞增殖性標記：如表皮生長因子受體(EGFR)、增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki-67等，表達指數越高，表明其增殖越活躍，惡性度增高，預後不良，其中以惡性淋巴瘤、乳腺癌較為明顯。而且在乳腺癌的研究中發現Ki-67、 PCNA 、EGFR陽性者，淋巴結轉移率高，並與激素受體的表達呈負相關。

9、輔助疾病診斷和分類

人體的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如腎小球腎炎、皮膚自身免疫性疾病等，可用免疫組化方法對組織細胞內的免疫球蛋白、補體、免疫復合物等進行檢測以輔助診斷。某些疾病的分類或分型也是在免疫組化基礎上建立的。內分泌腫瘤如垂體前葉腺瘤，根據其分泌功能可分為生長激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型;胰島細胞瘤的功能分類為胰島素瘤、高血糖素瘤等6種;惡性淋巴瘤根據瘤細胞表面標志不同可分為T細胞性、B細胞性。腎小球腎炎的免疫學分類亦需免疫組化或免疫熒光技術。

10、尋找感染病因

人體疾病的致病微生物中有的在常規病理檢查中不易發現，尤其是病毒性致病微生物，由於其分子水平的結構，在細胞水平上難以發現，通過免疫組化方法則可明確發現病原體抗原部位以及定量，如巨細胞病毒(CMV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)、乙型肝炎病毒(HBV)等，已有商品化標志物幫助解決病因診斷問題。

Ⅵ 免疫組化的作用是什麼呢

由於免疫組化具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點，且能將形態研究與功能研究有機地結合在一起，所以，這門新技術已被廣泛地應用於生物學和醫學研究的許多領域。在病理學研究中，免疫組化技術的作用和意義更為重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術出現以前，對腫瘤的診斷和分類還局限於細胞水平，而引入免疫組化技術後，則使研究的深度提高到了生物化學水平、分子水平。近年來，伴隨基因探針研究而興起的核酸分子原位雜交技術也正在蓬勃發展，更使免疫組化如虎添翼，兩者相得益彰， 將研究推進到了基因水平。分子生物學洗滌劑 http://proct.bio1000.com/101184/

Ⅶ 免疫組化技術的前言

——1941年 Coons 首先用熒光素標記抗體—檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。
—— 60年代 Nakane建立酶標抗體技術——鐵蛋白標記Ab技術。
—— 70年代 Stemberger 改良上述技術，建立辣根過氧化物酶——抗體過氧化物酶（PAP）技術，使免疫細 胞化學得到廣泛應用。
—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之後，免疫金—銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡 技術相繼問世。
—— 90年代 分子雜交技術、原位雜交技術、免疫細胞化學分類方法迅速發展。
——2000年 各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組化技術成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的 一項有力工具。其應用范圍深達醫學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。 （1）根據染色方式分成：① 貼片染色
② 漂浮染色
（2）根據Ag—Ab結合方式分成：
① 直接法
② 間接法
③ 多層法
（3）按標記物的性質分成：
① 免疫熒光技術（免疫熒光法）
② 免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD 法、 ABC法）
③ 免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） （1）必要性：組織細胞內Ag—Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。
（2）常用標記物
① 熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate ，FITC） —— 熒光顯微鏡下 呈綠色熒光
四乙基羅達明（rho—damine RB200）——熒光顯微鏡下發橙紅色熒光
② 酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶。
③ 生物素：（Biotin）
④ 鐵蛋白金等：主要應用於免疫電鏡。其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用） 1．直接法
熒光素直接標記特異性抗體（—抗）上，標記抗體與抗原結合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測抗 原。
△ 酶標抗體要顯示後鏡檢。
直接法優點：簡單，時間短，特異性強。 缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經濟）。 應用：基本不用！
2．間接法 熒光素標記在二抗上（二抗：抗產生一抗動物的 IgG抗體）。
※顯色後鏡檢
特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體→ 鑒定多種抗原。
3．非標記Ab橋法：
「橋法」是酶標記抗體的改進，經過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。
（1）單橋法
(2)雙橋法
在三抗之後，將二抗和三抗再重復一次，
可增大染色強度。
★ 特別提示：注意動物種屬關系
4．PAP法（過氧化物酶—抗過氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）
~ 是橋法的改良，既先形成PAP復合物→抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP復合物。
該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。
5．ABC法（親和素—生物素—過氧化物酶復合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC 法）
Avidin： 親和素，一種糖蛋白，其上有4個與生物素相結合的位點。
Biotin ： 生物素—維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。
ABC法與PAP法的區別是：以ABC復合物代替PAP復合物。
（1）ABC復合物的制備：
（2）ABC法反應原理
6．SP或SAP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵 白素或過氧化物酶標記的鹼性磷酸酶染 色） Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase）
※ 該法是ABC法基礎上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，而後再結合PO 。
它有4個亞基可與生物素結合，靈敏特異， 背景低，成本低。
現在還有plus盒。優點是：更簡便，放大倍數↑，等電點中性更適合組織。分子量小，穿透力↑。
7．蛋白A—金法（Protein—A gold method）
~多用於電鏡
8．雙重組化染色法
應用雙重免疫組織化學激素可在同一張切片，同一細胞或亞細胞結構內同時顯示兩種不同的抗原。
9．免疫金—銀染色法
（Immunogold—silver staining IGSS） 注意事項：
1．固定劑的選擇：因組織而不同，注意質量和
性能。
2．固定方式的選擇：① 浸漬固定（參考文獻）
② 灌注固定（+後固定）
③ 蒸汽固定 1．切片脫蠟入水，入PBS 洗三次/15分鍾。
2．封閉內源性過氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 （在PAS或0.05Tris—HCL緩沖液PH7.6中或甲醇中）室 溫，30 分鍾。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分鍾。
4．減少非特異性著色用稀釋20倍的正常血清（產生二次抗體動物血清！），室溫，30分鍾。
5．滴加第一抗體，4℃過液或室溫5′~1 hour。
6．0.1MPBS，洗三次，每次5分鍾。
7．滴加第二抗體，室溫15′~ 60′。
8．0.1MPBS 洗凈，洗三次，每次5分鍾。
9．滴加ABC復合物，室溫15~60分鍾。
10．0.1MPBS 洗三次，每次5分鍾。
11．0.05M Tris –HCL 5~10分鍾，此步可省略。
12．DAB—H2O2 顯色：用0.01%H2O2的DAB溶液，室溫5~30分鍾，隨時鏡檢（DAB用時新配）
13．自來水洗凈。
14．用Mayer 蘇木素或0.5%甲基綠，復染胞核（可不染）。
15．常規脫水、透明、封固、鏡檢。
結果：棕褐色反應產物代表抗原X的定位。 1．實驗計劃
① 根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無 交叉，則不能用其他 動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源於鼠，否則不能連接成復合物。
② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼於同一張載片上，否則無可比性。
③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。
2．Ab稀釋度 （如系購買的葯盒有工作液和原液）
（1）工作液：無須稀釋
（2）原液：
① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。
如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；
若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。
② 原液的保存（—20℃）凍存——應選最佳稀度凍存。
③ 若工作濃度大於1∶500則要先將原液稀釋十倍，而後分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）於 冰箱備用。
④ 關於Ab保存應參照說明書。
（3）Ab濃度的選擇
Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極 過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現假陰性。——並非Ab濃度越高越好。
3．Ab滴片技術
—— 所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。
[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄乾，但不能乾片。
要領：甩凈組織周圍的水。
4．PBS洗滌技術
（1）洗滌的目的
① 保證離子濃度和PH值。
② 減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）
（2）方法：洗三次，每次5分鍾。
5．Ab孵育技術
（1）必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發和乾片。
（2）溫度與時間 4℃：過夜；
37℃：2 h or 參考說明書
6．光鏡控制顯色方法
（1）室內操作：注意溫度與時間的關系，室溫最宜5分鍾。
（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片後顏色可加深。 從以下幾 個方面綜合評價：
1．陽性染色特點
① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區別）
② 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）
2．組織切片製作過程的影響
① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。
② 邊緣乾燥—非特異性染色（常見），加抗體時勿乾片。
3．人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。
陽性對照：
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果，標為陽性對照。
陰性對照：
用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照 還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。
▲ 染色失敗的幾種原因：
（1）所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性 對照在內。全部（－）原因可能：
① 染色未完全嚴格按照操作步驟進行；
② 漏加一種抗體，或抗體失效；
③ 緩沖液內含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；
④ 底物中所加H2O2 量少或失效；
⑤ 復染或脫水劑使用不當
（2）所有切片均呈陽性反應，原因可能是：
① 切片在染色過程中抗體過濃，或乾燥了。
② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不徹底。
③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長。
④ 抗體溫育的時間過長。
⑤ H2O2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。
（3）所有切片背景過深，原因可能是：
① 未加酶消化處理切片。
② 切片或塗片過厚。
③ 漂洗不夠。
④ 底物呈色反應過久。
⑤ 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。
（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因是：標本的固定和處理不當。

Ⅷ 組織晶元技術在免疫組化及原位雜交陽性對照中如何應用拜託各位了 3Q

組織晶元技術其優點是可對大量的組織標本進行了各種檢查，對腫瘤病理學、免疫學等研究具有可行性和可比性，同時有節省時間，節約成本的優點，對病理學研究 具有較多的優越性，如對各種組織起源的不同類型腫瘤進行免疫組織化學染色等研究，對各種抗體的敏感性及特異性的檢測，因其實驗條件的一致性，所以各種實驗 結果的准確性、科學性、可比性[6-8]均有了保證。 免疫組織化學及原位雜交中的設立陽性對照是對免疫組化染色結果的准確性和可靠性保證，自身陽 性對照為最佳和首選，傳統外部的陽性對照組織切片為單獨一張切片，組織面積大且不宜與待檢測組織在同一張切片上染色，多消耗試劑，有時也達不到實驗條件的 一致性，而應用組織晶元技術在免疫組化及原位雜交中設立陽性對照有以下優點。 1)對一些抗體如p53、c-erbB-2、CD117、MART-A等，可針對性的選擇陽性對照組織，摒棄陰性對照，同時節約了陽性對照組織，又可以節省試劑的成本。 2) 符合病理診斷的質控要求，提高病理報告的准確性和科學性，避免了因免疫組化結果不理想而導致出現病理診斷的疑難或病理診斷的誤區。即使疑難病例病理切片會 診，免疫組化或原位雜交切片因每一張切片上附有陽性染色對照組織，不會再次重復進行同樣種類的免疫組化或原位雜交檢測，節約醫療開支。 …………… …………………… 更多具體材料請參考： 晶元掃描儀及配件： http://proct.bio1000.com/100114/

求採納

Ⅸ 免疫組化染色技術成功的關鍵是

正確答案:C
解析：抗體的質量是免疫組織化學技術成功的關鍵，同時也是必備試劑
。使用前應了解第一抗體和第二抗體的特異性和敏感性；通過預試驗決定抗體的最佳稀釋度；在已知陽性和陰性的標本上觀察實驗結果的符合情況
。

Ⅹ 免疫組化原理

免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助於了解疾病的發病機理和病理過程。
免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，製成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用於標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。