雜交技術怎麼操作

1. 分子雜交技術的幾種常見的雜交

分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然後用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影後顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：
(1) Southern雜交:DNA片段經電泳分離後,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然後與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。
(2) Northern雜交:RNA片段經電泳後,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上,然後用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。
根據雜交所用的方法,另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用於雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴格按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度,最早用於篩選細菌菌落。該濾紙主要用於篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優點:它更便宜,雜交中更耐用,乾燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強度會明顯弱於用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此,常規的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 Southern雜交可用來檢測經限制性內切酶切割後的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然後使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然後漂洗除去非特異性結合的探針。
(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交能否檢出雜交信號取決於很多因素,包括目的DNA在總DNA中所佔的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數天後, Southern雜交能很靈敏地檢測出低於0.1pg與32 P標記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉移到濾膜上，並與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。
將DNA從凝膠中轉移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細管轉移。本方法由Southern發明,故又稱為Southern轉移(或印跡)。毛細管轉移方法的優點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長,轉移後雜交信號較弱。(2)電泳轉移。將DNA變性後,可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優點是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉移較大的DNA片段。缺點是轉移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管轉移和真空轉移無效時,才採用電泳轉移。(3) 真空轉移。有多種真空轉移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置於濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優點是快速,在30分鍾內就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉移出來。轉移後得到的雜交信號比Southern轉移強2-3倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂, 並且在洗膜不嚴格時,其背景比毛細轉移要高。
1、材料： 待檢測的DNA，已標記好的探針。
2、設備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過濾除菌後於-20℃儲存。
(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲於4℃。
(4)預雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲醯胺。
(5)雜交溶液:預雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L HCl調節pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然後在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(包括DNA分子量標准物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鍾, 然後照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,並輕微搖動: 500ml 0.2mol/L HCl 10分鍾, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時間為20分鍾)，用水清洗數次,傾去溶液; 500ml變性溶液兩次,每次15分鍾,傾去溶液; 500ml中和溶液30分鍾。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC液,將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透,再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次准確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜,然後加上乾的3濾紙和干紙巾,根據DNA復雜程度轉移2-12小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉移時用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡單的印跡轉移2-3小時,對於基因組印跡,一般需要較長時間的轉移。
(5) 去除紙巾等,用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉移日期,做好記號,取出濾膜,在2×SSC中洗5分鍾,涼干後在80℃中烘烤2小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能空氣乾燥，不得烘烤。
(6) 將濾膜放入含6-10ml預雜交液的密封小塑料袋中,將預雜交液加在袋的底部,前後擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預雜交3-12小時，棄去預雜交液。
(7) 制備同位素標記探針（參見第一節），探針煮沸變性5分鍾。
(8) 在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預雜交相同溫度下雜交6-12小時。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,並輕輕搖動: 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鍾, 兩次。 在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鍾, 兩次。
(10) 空氣乾燥硝酸纖維素濾膜,然後在X光片上曝光。通常曝光1-2天後可見DNA譜帶。對於≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測到10pg的單拷貝基因。 Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳後的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上,然後與探針雜交。
1、材料：待檢測的RNA及制備好的探針。
2、設備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉，溶於800ml水中，用10mol/LNaOH調pH至7.4，定溶到1L。
(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應用DEPC處理。
4、操作步驟：
(1)RNA經變性電泳完畢後,可立即將乙醛醯RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。
(2)轉移完畢後 ,以6×SSC溶液於室溫浸泡此膜5分鍾,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾於兩張濾紙中間,用真空烤箱於80℃乾燥0.5-2小時。
(4) 用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間為1-2小時。若於42℃進行,應採用: 50%甲醯胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS；若於68℃進行,應採用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用於Northern雜交）。
(5) 在預雜交液中加入變性的放射性標記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應大於2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS於室溫洗膜20分鍾,隨後用0.2×SSC、0.1% SDS於68℃洗膜3次,每次20分鍾。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當的產品)進行放射自顯影,附加增感屏於-70℃曝光24-48小時。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高於1%，或凝膠厚度大於0.5cm，或待分析的RNA大於2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鍾,部分水解RNA並提高轉移效率。浸泡後用經DEPC處理的水淋洗凝膠,並用20×SSC浸泡凝膠45分鍾。然後再轉移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛醯RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)於65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝膠轉移至尼龍膜所用方法，與RNA轉移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA轉移前需用經DEPC處理的水淋洗數次,以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在鹼性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛醯RNA，同時可部分水解RNA，並提高較長RNA分子(>2.3kb)轉移的速度和效率。此外，鹼可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定後洗脫的步驟。乙醛醯RNA在鹼性條件下轉移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉移的方法進行，但轉移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉移結束後(4.5-6.0小時)，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、於室溫晾乾。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置於高濃度的鹼性溶液中,會導致雜交背景明顯升高,可通過提高預雜交和雜交步驟中有關阻斷試劑的量來予以解決。
(6)如用中性緩沖液進行RNA轉移,轉移結束後,將晾乾的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時,或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。後一種方法較為繁瑣,但卻優先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理後,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進RNA上小部分鹼基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構,而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價結合於尼龍膜表面,導致雜交信號減弱。 對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可採用本方法。將這些菌落歸並到一個瓊脂主平板以及已置於第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間後，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存於4℃直至得到篩選結果。
1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。
2、設備：恆溫烤箱，恆溫水浴，台式高速離心機等。
3、試劑：
(1)LB固體培養基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris·Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris·Cl。
(6)預洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)預雜交液：50%甲醯胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲醯胺可不用)。
(8)其餘試劑：與Southern雜交相同。
4、操作步驟：
1. 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線於兩個平板的相同位置上。最後，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,於37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放於4℃,直至獲得雜交反應的結果。
(6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結合於硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結合於硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上製作一個裝有0.5mol/L NaOH的小窪(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小窪上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留於原處2-3分鍾。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配製的0.5mol/L NaOH重復步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜窪上。5分鍾後吸干濾膜, 再重復一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小窪上5分鍾後吸干濾膜,轉移到一張乾的濾紙上,置於室溫20-30分鍾,使濾膜乾燥。
(5) 將濾膜夾在兩張乾的濾紙之間,在真空烤箱中於80℃干烤2小時,固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標記的探針雜交。
5.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鍾。
(2) 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放於溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位於培養箱內的旋轉平台上。於50℃處理30分鍾。在這一步及以後的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲醯胺中雜交時用42℃)下,預雜交1-2小時。
(5) 將32 P標記的雙鏈DNA探針於100℃加熱5分鍾,迅速置於冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
(6) 雜交結束後,去除雜交液,立即於室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鍾，並將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次，同時應避免膜乾涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液於68℃將濾膜浸泡60分鍾。
(8) 把濾膜放在紙巾上於室溫晾乾後,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,並在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片並加上增感屏於-70℃曝光12-16小時。
(10) 底片顯影後,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。 斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然後與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經常用到,是研究基因表達的有力工具。但由於目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區分目的序列信號和干擾信號。
1、材料：待分析的DNA或RNA樣品，已標記的探針。
2、設備：狹槽點樣器，真空泵，恆溫水浴，真空烤箱等。
3、試劑：
（1）100% 甲醯胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纖維素濾膜。
（6）濾紙。
4、操作步驟：
(1) 10μl樣品與20μl 100%甲醯胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置於68℃，15分鍾後置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗點樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經20×SSC浸潤的濾紙鋪在點樣器上,上面再鋪上一張經20×SSC浸潤1小時的硝酸纖維素濾膜，加蓋並夾緊，接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合後加樣於孔中。外圍幾個孔中加2μl染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗兩次。繼續抽吸5分鍾,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘乾2小時。按上述Southern或Norhtern雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時應注意濾膜必須乾燥，並覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以後的操作困難。
2、在雜交過程中，整個濾膜應一直是濕潤的，不得乾涸。
第三節 雜交反應的條件及參數的優化
不同的反應條件對雜交結果的影響如下：
(1) 根據雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲醯胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，並和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結果，但它不能用於RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據需要在雜交過程中選用不同的振盪方法和程度,許多雜交膜一起反應時,連續的輕微振盪可獲得較好的雜交結果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導致本底較高，並由於溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低於雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C鹼基對的序列比富含A·T鹼基對序列的Tm 溫度高。有關Tm的計算方法，請參考第八章。
(7) 根據標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。
(8) 在水溶液中雜交時,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲醯胺溶液中雜交時,應該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變，對雜交的結果有不同的影響，應根據研究的具體情況，選用適當的方法。

2. 嫁接雜交怎樣操作

利用嫁接技術將兩親本結合在一起，促使結合部長出具有雙親遺傳特性的變異體的方法。通過嫁接方法產生雜種，源出於達爾文著《在馴化狀態下動植物的變異》（1885年）一文中，達爾文寫道：「現在都已深信通過嫁接獲得雜種是可能的，甚至是容易的。」他引證佛羅倫薩栒櫞（Citrus medica L.）嫁接在酸橙上（Citrus au-rantium L.）的嫁接雜種——比扎利亞橙（Bizzaria orange）（見圖）。隨後美國的伯班克，法國的丹尼埃爾等都以達爾文的觀點進行研究。蘇聯的米丘林進一步研究用嫁接方法，培育雜種實生苗的蒙導法，和利用預先無性接近法，克服遠緣種的不孕，提出嫁接蒙導法作為育種工作的一種新方法，並培育出蘋果和梨的嫁接雜種。

從達爾文所列舉的許多嫁接雜種，以及隨後一些學者進行嫁接雜交實驗所獲得的雜種，經研究證明是嵌合體，並沒有因嫁接而產生兩種細胞融合的真正雜種。另外，有些實驗表明，當一個嫁接成分吸收另一個成分的可塑性物質，使接穗化學合成向砧木特有的方向改變。但取其枝條繁殖時，這種變化便會消失，說明砧木影響下接穗所產生的這種變異是不能遺傳的，因為嫁接未引起砧木和接穗之間基因的交換。至於嫁接繁殖時，接穗產生的突變，或實生苗接穗所產生的變異，則不屬於嫁接雜交的范疇。

3. 雜交水稻是怎樣雜交的

選用兩個有差異的水稻品種，讓它們進行雜交，互補優良的性狀，來產生品種優良的水稻。通過雜交的水稻，一般可以提高抗病性和抗倒伏性，並且可以增加產量。

水稻具有明顯的雜種優勢現象，主要表現在生長旺盛，根系發達，穗大粒多，抗逆性強等方面，因此，利用水稻的雜種優勢以大幅度提高水稻產量一直是育種家夢寐以求的願望。

但是，水稻屬自花授粉植物，雌雄蕊著生在同一朵穎花里，由於穎花很小，而且每朵花只結一粒種子，因此很難用人工去雄雜交的方法來生產大量的第一代雜變種子，所以長期以來水稻的雜種優勢未能得到應用。

第三代雜交水稻

第三代雜交水稻技術是以遺傳工程雄性不育系為遺傳工具，它讓所有的水稻，在理論上都能找到適合自己的「另一半」，並產生優良後代。

第三代雜交水稻不僅兼有三系不育系育性穩定和兩系不育系配組自由的優點，同時還克服了三系不育系配組受限，兩系不育系可能因天氣原因導致制種失敗和繁殖產量低的缺點，在任何地區任何時候都是穩定不育的，且制種和繁殖都非常簡便。

4. 核酸印跡雜交技術的一般步驟有哪些

並介紹了點雜交的基本概念及實驗原理、方法. 幾種核酸雜交技術的比較?點雜交實驗原理、步驟（1）幾種核酸雜交的異同點核酸雜交是分子生物學的基本技術,也是遺傳學研究和基因診斷的常用方法.核酸雜交的形式有多種,其中最常用的是Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、點雜交等.雖然形式多樣,但都是基於核酸分子的鹼基互補原理.從雜交材料來看,雜交分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交.從雜交分子狀態來看,雜交分為液相-固相雜交和液相-液相雜交. 上述幾種雜交都屬於液相-固相雜交,即將參與雜交的一方分子固定在固相的支持載體上,另一方分子以液相形式參與雜交.參與雜交的雙方分子必有一方被標記,以便產生能夠被檢出的雜交信號;在液相-固相雜交中往往液相分子被標記,這樣才能產生有意義的差別信號.在雜交在中,被標記的分子稱為探針,而與探針進行雜交的分子稱為被檢測樣品(被檢分子).大多數液相-固相雜交中被檢樣品往往是混合分子,如提取的基因組DNA或某種組織的RNA,並且將被檢樣品固定在載體上,而探針往往是單一分子,如某一基因的片斷.雜交結果是根據信號的強弱和位置進行判斷,如被檢分子的分子量(或長度),被檢分子的表達強度等.這種雜交適用於相同基因片斷對不同樣品的檢測.若進行一種樣品被不同基因片斷的檢測時,就必須採取反向的方式,即將不同的基因片斷固定在載體上,而將被檢樣品製成液相並進行標記.這種反向的方式稱為反向雜交,反向雜交中被標記的樣品也可以稱為探針. 在液相-固相雜交中固相載體往往採用尼龍膜或醋酸纖維膜,這些經過特殊處理的材料對核酸分子具有強大的吸附力,在操作中不易脫落.探針標記往往採用放射性標記,如32P、35S等,由於放射性物質的危害性,現在非放射性標記也在廣泛使用,如生物素標記、地高辛標記等.一般來說,放射性標記適用於Southern雜交、Northern雜交和點雜交,非放射性標記適用於原位雜交.放射性標記靈敏度高,線形范圍寬,非放射性標記定位性強,沒有衰變,危害小. （2）點雜交的概念點雜交(dot blot)是雜交信號呈現斑點樣的雜交方法,在操作上是把參與雜交的一方分子點樣到膜上.由於雜交分子預先沒有進行像Southern雜交和Northern雜交之前的電泳分離,也沒有像原位雜交那樣,雜交一方的分子已經表現出組織細胞分布的位置特異性,所以點雜交的結果判斷完全視雜交信號的強弱,其信息量沒有其它雜交形式的信息量豐富.但點雜交的操作比較簡單、結果直觀、適用於大批樣品的檢測,因此它在許多方面也得到了廣泛的應用. 一、實驗目的理解核酸雜交原理;熟悉核酸雜交的一般方法,掌握膜斑點雜交技術和結果分析. 二、實驗原理點雜交是核酸雜交中比較簡單的一種技術,本質上也是單鏈核酸分子通過鹼基互補而形成雙鏈核酸的過程,當某單鏈分子被標記後,就可以檢測與其互補的分子. (一)印跡印跡(blot)就是將雜交一方的分子固定在膜上,對於Southern雜交和Northern雜交,往往採用毛細轉移,真空轉移或電轉移等方法,使電泳分離的核酸分子「原位印跡」到膜上去,而點雜交則可採取人工點樣的方法,將核酸分子固定到膜上去.在點膜時還要藉助其它使核酸分子固定的方法(如點膜器、真空抽氣裝置)使分子更緊密地結合在膜上,並且不擴散.點雜交的印跡過程提供了一個固化平台和陣列,使雜交在已知位置上進行. (二)標記標記(labeling)就是使參與雜交的一方分子帶有可識別的物質,使雜交後顯示信號.常用標記物有放射性同位素和非放射性物質,標記方法有隨機引物標記法、缺口平移法和末端標記法等.在液相-固相雜交中,標記往往在液相分子上,使探針成為流動相.標記效率是影響雜交的重要因素,在一定范圍內,比活性(可以理解為單位分子中的標記物數量與活性)越高越好.在雜交中,探針往往是過量的(雜交信號的強弱反映的是被檢樣品的量和基因豐度),所以依靠增加探針量來提高雜交靈敏度的做法很有限的,應該提高探針的比活性.

5. 什麼是雜交育種舉一例並用遺傳圖解表示該過程。

不同種群、不同基因型個體間進行雜交，並在其雜種後代中通過選擇而育成純合品種的方法。雜交可以使雙親的基因重新組合，形成各種不同的類型，為選擇提供豐富的材料；基因重組可以將雙親控制不同性狀的優良基因結合於一體，或將雙親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產生在各該性狀上超過親本的類型。正確選擇親本並予以合理組配是雜交育種成敗的關鍵。根據育種目標要求，一般應按照下列原則進行：①親本應有較多優點和較少缺點，親本間優缺點力求達到互補。②親本中至少有一個是適應當地條件的優良品種，在條件嚴酷的地區，雙親最好都是適應的品種。③親本之一的目標性狀應有足夠的遺傳強度，並無難以克服的不良性狀。④生態類型、親緣關繫上存在一定差異，或在地理上相距較遠。⑤親本的一般配合力較好，主要表現在加性效應的配合力高。

雜交育種是培育家畜新品種的主要途徑。通過選用具有優良性狀的品種、品系以至個體進行雜交，繁殖出符合育種要求的雜種群。在擴大雜種數量的同時要適當進行近交，加強選擇，分化和培育出高產而遺傳性穩定，並符合選育要求的各小群，綜合為新品種。

所謂雜交育種，一般指種內不同品種間的雜交育種。雜交技術因不同作物特點而異，其共同要點為：調節開花期，通過分期播種、調節溫度、光照及施肥管理等措施，使父母本花期相遇；控制授粉，在母本雌蕊成熟前進行人工去雄，並套袋隔離，避免自交和天然異交，然後適期授以純凈新鮮花粉，作好標志並套袋隔離和保護。用於雜交的父本和母本分別用P1和P2表示，其代表符號分別為♂和♀；×表示雜交。雜交所得種子種植而成的個體群稱雜種一代（子一代），用F1表示。F1群體內個體間交配或自交所得的子代為F2、F3、F4等表示隨後各世代。安排親本或雜種成對使之交配的雜交方式有：成對雜交（單交）即兩個不同品種或系統間的雜交，兩親可互為父母本（正反交）；復合雜交，即幾個品種分別先後進行多次雜交。回交是以雜種後代與親本之一再交配的雜交方式。

雜交創造的變異材料要進一步加以培育選擇，才能選育出符合育種目標的新品種。培育選擇的方法主要有系譜法和混合法 。 系譜法是自雜種分離世代開始連續進行個體選擇，並予以編號記載直至選獲性狀表現一致且符合要求的單株後裔（系統），按系統混合收獲，進而育成品種。這種方法要求對歷代材料所屬雜交組合、單株、系統、系統群等均有按親緣關系的編號和性狀記錄，使各代育種材料都有家譜可查，故稱系譜法。典型的混合法是從雜種分離世代F2開始各代都按組合取樣混合種植，不予選擇，直至一定世代才進行一次個體選擇，進而選拔優良系統以育成品種。在典型的系譜法和混合法之間又有各種變通方法，主要有：改良系譜法、混合-系譜法、改良混合法、衍生系統法、一粒傳法。不同性狀的遺傳力高低不同。在雜種早期世代往往又針對遺傳力高的性狀進行選擇，而對遺傳力中等或較低的性狀則留待較晚世代進行 。選擇的可靠性以個體選擇最低，系統選擇略高，F3或F4衍生系統以及系統群選擇為最高。選擇的注意力也最高。因此隨雜種世代的進展，選擇的注意力也從單株進而擴大到系統以至系統群和衍生系統的評定。試驗條件一致性對提高選擇效果十分重要。為此須設對照區，並採取科學和客觀的方法進行鑒定，包括直接鑒定、間接鑒定、自然鑒定或田間鑒定、誘發鑒定或異地鑒定。雜種早代材料多，一般採取感官鑒定。晚代材料少，再作精確的全面鑒定。

作物育種程序在中國一般包括以下環節：原始材料觀察、親本圃、選種圃、產量比較試驗。雜交育種一般需7～9年時間才可能育成優良品種 ，現代育種都採取加速世代的做法，結合多點試驗、稀播繁殖等措施，盡可能縮短育種年限。

6. 分子雜交技術具體包含了哪些物質的雜交技術這些技術之間有什麼不同

分子雜交（molecularhybridization）確定單鏈核酸鹼基序列的技術。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過鹼基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。
探針：標記方法有多種，常用的為同位素標記法和生物素標記法。雜交方法又可分為液相雜交和固相雜交。
雜交技術：目前使用較多的是固相雜交法。此法是先將待測單鏈核酸樣品（如為雙鏈，則須先變性成為單鏈）結合到硝酸纖維素膜上，然後與溶液中的標記探針進行雜交。通過與電泳法和放射自顯影法結合，獲得雜交圖譜，再進行定性或定量分析。分子雜交方法廣泛用於生物化學、分子生物學中作為核酸片段鹼基序列的檢測與鑒定手段。在醫學領域中已用於某些病毒或細菌引起的感染性疾病的診斷。它也可用於基因工程。不同來源蛋白質的亞基結合過程也可稱為雜交。
在液相分子雜交中，兩種來源的核酸分子都處於溶液中，可以自由運動，其中有一種常是用同位素標記的。從復性動力學數據的分析可探知真核生物基因組結構的大致情況，如各類重復順序的含量及分布情況等。在固相分子雜交中，一種核酸分子被固定在不溶性的介質上，另一種核酸分子則處在溶液中，兩種介質中的核酸分子可以自由接觸。常用的介質有硝酸纖維素濾膜、羥基磷灰石柱、瓊脂和聚丙烯醯胺凝膠等。早期用瓊脂作為固定介質的分子雜交方法曾被用來測定從細菌到人多種生物的DNA的同源程度。

（1）固相雜交
將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。由於固相雜交後，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優點，所以最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
（2）液相雜交
所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中，一種研究最早且操作復合的雜交類型，在過去的30年裡雖有時被應用，但總不如固相雜交那樣普遍。主要缺點是雜交後過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由於雜交檢測技術的不斷改進，商業性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術的迅速發展。
編輯本段固相膜核酸分子雜交（1）菌落原位雜交
（Colonyinsituhybridization）
將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA，再烘乾固定DNA於膜上，與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，並與平板上的菌落對位。
（2）斑點雜交
（Dotblotting）
該方法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣准確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤乾或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。
（3）Southern印跡雜交
（Southernblotting）
是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化後，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然後經鹼變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長用）上，烘乾固定後即可用於雜交。凝膠中DNA片段的相對位置轉移到濾膜的過程中繼續保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（4）Northern印跡雜交
（Northernblotting）
DNA印跡技術由Southern於1975年創建，稱為Southern印跡技術。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為westernblotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2』-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得並不牢固，所以在轉印後不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之後將標記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進行Northern轉印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。
（5）組織原位雜交
（Tissueinsituhybridization）
簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然後進行雜交。而原位雜交是經適當處理後，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對緻密染色體DNA的原位雜交可用於顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。
用於原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針，探針的長度通常以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高於長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優選探針。