pcr擴增技術以什麼形式

❶ pcr擴增的原理

PCR擴增的基本原理類似於DNA的天然復制過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR是一種體外DNA擴增技術,是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴於DNA聚合酶的酶促合反應,將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物PCR擴增儀延伸」三步反應的多次循環,使DNA片段在數量上呈指數增加,從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環境檢測中,靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中,且含量很低,對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因,雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級,再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用,如RT-PCR、競爭PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。

❷ 什麼是PCR技術PCR的基本原理是什麼

PCR技術是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。

PCR技術的基本原理：類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

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PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

❸ 什麼是pcr技術典型的pcr技術分為幾個步驟

Pcr技術是指DNA的體外擴增技術，也叫DNA多聚酶鏈式反應，該技術分為變性、復性和子鏈延伸三個步驟，變性是高溫下DNA解開雙鏈，復性是DNA模板鏈與引物配時，子鏈延伸是按鹼基互補配對原則合成子鏈。

❹ 什麼是PCR技術

PCR技術是模擬體內DNA的天然復制過程，在體外擴增DNA分子的一種分子生物學技術，主要用於擴增位於兩段已知序列之間的DNA區段。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環後，DNA擴增2ⁿ倍。

PCR的每個循環過程包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個不同的事件：（①變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃左右）雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火；使溶液溫度降至50~60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合。

3、延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3』方向復制出互補DNA。

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【技術原理】

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。

因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

【工作原理】

類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火（復性）--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至90~95℃一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至50~60℃，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在DNA聚合酶的作用下，於70~75℃，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」。

而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

【工作步驟】

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

❺ 目前的定量pcr方法基本上可歸為哪幾種

1、外參法+終產物分析。外參法是指樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應。
2、內參法+終產物分析。謂「內參法」是指樣本與陽性參照在一個反應容器內反應。
3、外標法+過程監測。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，但是無法排除假陰結果。
4、內參法+過程監測。由於樣本與陽性參照在一個容器內反應，用同樣的Taq酶和反應參與物，存在竟爭性抑制。
5、外標法+過程監測+內對照。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，同時排除假陰結果。上述是定量pcr方法的五種類型。

❻ pcr擴增的原理和步驟

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環，使DNA得以成百萬倍的擴增。

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PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。

這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。

它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

❼ 如何理解pcr擴增的原理和過程

PCR原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。

因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」。

而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

pcr擴增步驟

標準的PCR過程分為三步：

DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

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試驗污染

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

污染原因

1、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由於密封不嚴溢於容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由於吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染：主要是由於在PCR試劑配製過程中，由於加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴增產物污染：這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高於PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。

在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

4、實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由於活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什麼原因造成的污染，以便採取措施，防止和消除污染。

1、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。

但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以後的實驗中可免設陽性對照。

2、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括：

（1）標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定後的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。

（2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

3、重復性試驗。

4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

參考資料來源：網路-DNA的PCR擴增

參考資料來源：網路-聚合酶鏈式反應

❽ 什麼叫PCR技術

PCR技術也就是基因擴增技術，它是通過基因擴增儀，在細胞外進行DNA復制，由1個DNA分子增加到2個，然後依次增加到4個，8個…，使分子數目呈幾何級數增加，以在短時間內獲得足夠的DNA，供研究用的一種技術。

PCR技術的出現，使生物學的研究一大突破。在PCR技術問世之前，人們無法查出愛滋病病毒感染者，因為這種病毒在感染者體內的含量很少，且難於培養。在PCR技術問世之後，可將愛滋病病毒的核酸進行擴增從而查出受感染者，並可研究治療方法。

PCR技術，還可對運動場上男扮女裝的「女運動員」加以識別。過程如下：從自報是女運動員頭上取1根帶毛囊的頭發，加蒸餾水煮沸，，使毛囊細胞破裂；把高速離心分離出的染色體放入其因擴增儀中進行基因擴增；大約2小時後，用一定的染料對擴增液染色；最後，把經染色的擴增液體塗在瓊脂板上，用紫外線照射，如果出現橘紅色光帶，則說明染色體中含有睾丸決定基因（在Y染色體上），為男性，否則為女性。

目前，這項技術是性別鑒定中的最佳技術，准確性可達100%，也是迄今為止最文明的性別檢測法之一，只要1根毛發即可辨男女。

1992年，在巴塞羅那奧運會上，組委會決定首先使用基因擴增法識別性別，但由於准備不足，只局限用於最可疑的少數運動員。1993年，在我國上海舉行的首屆東亞運動會上，全面使用了這一技術。在這屆運動會前夕，有關科研人員進行了1037例「預試」，還進行了10例「雙盲」（驗方和遞方都不知道頭發是取自男還是女）試驗，結果表明，准確率達100%！這種既文明又准確的性別鑒定法，解除了「性別舞弊」對運動會官員的困擾。

PCR技術已經在分子生物學中發揮了重要作用。可以預知，它在遺傳病診斷、治療，在動、植物育種，以及在司法破案等方面，將會發揮更大的作用。

❾ 什麼是PCR擴增技術

基因擴增技術（PCR）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由於PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點，已在病原微生物學領域中顯示出巨大的應用價值和廣闊的發展前景。PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然後加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個鹼基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合後，以靶DNA單鏈為模板，經反鏈雜交復性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復製成雙鏈。然後又開始第二次循環擴增。引物在反應中不僅起引導作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，並又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重復上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程，使每次循環延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反復循環，使靶DNA片段指數性擴增。

❿ pcr技術以指數方式擴增嗎

A、PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開，A錯誤；
B、PCR技術體外復制DNA以指數形式擴增，B正確；
C、PCR技術的原理是DNA復制，C正確；
D、PCR技術的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，便於根據這一序列合成引物，D正確．
故選：A．