遺傳學有哪些診斷技術

㈠ 能夠實現基因診斷的臨床應用有哪些

基因診斷又稱DNA診斷，是70年代末迅速發展起來的一項應用技術，目前已廣泛應用於臨床許多疾病的診斷，包括遺傳性疾病的基因診斷、腫瘤的基因診斷、感染性疾病的基因診斷、法醫學鑒定中的基因診斷、疾病易感性的基因診斷、葯物篩選和葯物開發的基因診斷等，本文對基因診斷在臨床的應用及其應用過程中存在的問題進行綜述。
與其他診斷方法相比，基因診斷具有突出的優點：一是能從基因水平徹底揭示疾病病因及發病機理；二是可進行症狀前診斷，能顯著提早產前診斷的時間；三是取材少，來源廣，微量標本即可進行診斷；四是可快速檢測不易在體外培養（如艾滋病病毒、各種肝炎病毒等）和不能再實驗室安全培養的病原體。因此，基因診斷迅速在臨床診斷領域特別在遺傳病研究領域得到了較為廣泛的應用。 1.基因診斷在臨床的應用 1.1遺傳性疾病的基因診斷：目前已發現的人類遺傳性疾病達數千種之多，分為單基因缺陷造成的遺傳病（包括顯性遺傳、隱性遺傳、X-染色體連鎖遺傳病等）、多基因缺陷導致的復雜因素遺傳病以及染色體數目異常的遺傳病。隨著對多種遺傳病致病基因和突變類型以及許多可用於基因連鎖分析的遺傳標志的澄清，再加上基因診斷方法學的不斷改進和更新，使得基因診斷被廣泛地應用於遺傳病的診斷中。目前遺傳病基因診斷所取得的成績最為顯著和突出。地中海貧血是一種常見的嚴重危害的遺傳性血液病。Drobyshev等用10聚體的寡核苷酸微集晶元，成功檢測β-地中海貧血患者紅細胞中β-珠蛋白基因中的3個突變位點[1]。血友病B是凝血因子Ⅸ基因缺陷引起的一種X染色體連鎖隱性遺傳病，關節腔和肌肉出血是嚴重病例的特徵性表現。目前只能對下列遺傳病進行基因診斷：已知特定基因位點突變或缺失的單基因病；已知與特定突變基因突變處於連鎖不平衡的DNA標記RFLP；檢查癌細胞染色體重排；新生兒死亡一擊基因已被克隆的或有DNA連鎖標記的遺傳性酶病[2]。 1.2腫瘤的基因診斷：腫瘤的形成是遺傳因素與環境因素相互作用的結果。癌基因、抑癌基因及其產物作為腫瘤標志物在腫瘤診斷，檢測腫瘤復發與轉移，判斷療效和預後以及人群普查等方面都有較大的實用價值。通過檢測癌基因、抑癌基因中發生的基因突變有助於腫瘤的早期診斷。抑癌基因p53是人類腫瘤中最常見的突變基因，約50%以上的腫瘤都存在該基因的突變，通過將p53基因外顯子2-11區域內所有突變位點的突變探針以及對應的正常序列探針集成在一塊晶元上，製成p53基因晶元，為腫瘤的早期診斷、分類提供一條新途徑。SPLUNCL蛋白、p16基因、p27基因等可以作為鼻咽癌的診斷標志物，用於鼻咽癌的早期診斷[3]。 1.3感染性疾病的基因診斷：採用形態學、生物化學貨血清學診斷細菌、病毒、寄生蟲和真菌等感染性疾病，有時存在靈敏度低、特異性差及速度慢等不足之處，基因診斷技術可以克服這些不足，它既能檢出正在生長的病原體，也能檢出潛伏的病原體；既能確定既往感染，也能確定現行感染。 1.4法醫學鑒定中的基因診斷：主要是針對人類DNA遺傳差異進行個體識別和親子鑒定。其中最常用的基因診斷技術是DNA指紋技術、擴增片段長度多態性分析技術以及檢測基因組中短串聯重復序列遺傳特徵的PCR-STR技術和檢測線粒體DNA的PCR-mtDNA技術。 疾病易感性的基因診斷：基因診斷在判斷個體對某種重大疾病的易感性方面起著重要作用。如人類白細胞抗原復合體的多態性與一些疾病的遺傳易感性有關。 1.5器官移植組織配型中的基因診斷：器官移植的主要難題時如何解決機體對移植物的排斥反應。基因診斷技術能夠分析和顯示基因型，更好地完成組織配型，從而有利於提高器官移植的成功率[4]。 1.6葯物篩選和葯物開發中的基因診斷：由於晶元技術具有高通量、規模、行性等特點，可以進行新葯的篩選，尤其在對中葯成分的真偽鑒定及有效成分的篩選、理學研究、化學葯物的合成等方面具有重要的葯化作用。且用基因晶元作大規模的篩選研究可以省略大量的動物實驗，縮短葯物篩選所用時間。 1.7胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）：GPD是體外獲取卵子或植入前胚胎，經極體或卵裂球活檢，檢測胚胎的染色體和基因，將無病胚胎植入母體子宮，以獲取正常子代的技術，是一項實現診斷時機前移、避免選擇性流產、可應用於不育患者並能達到源頭阻斷遺傳病傳遞的積極優生技術。目前在我國，該項目開展十分有限，總體處於起步階段。使用到的技術包括單個卵裂球熒光原位雜交、多色/多重FISH等基於單細胞的染色體分析技術；單細胞巢式/多重巢式PCR等基於單細胞的基因診斷技術；全基因擴增技術等[5] 。 2.基因診斷在臨床應用存在的問題 2.1基因診斷中的倫理問題：目前使用基因診斷方法所測得的結果是否可靠？被診斷為基因缺陷陽性的人如何得到法律保障，使他們不受人壽保險、招聘單位和社會的歧視？等等，目前推廣使用基因診斷方法是否合適還值得商榷。某些遺傳疾病通過基因診斷技術雖然可以明確病因，但是，若不能給予有效治療，這種基因診斷對患者自身的生活將可能意味著負擔和麻煩。基因診斷可能導致新的種族歧視並最終使納粹的人種改良企圖死灰復燃[6]。 2.2基因診斷技術的標准化問題：基因診斷技術的發展歷史較短，有的問世只有數年，最多也就20餘年，故目前尚缺乏標准化的操作規程和質量認證體系，各研究機構之間、各醫療機構的實驗室之間尚存在方法不統一，質量難保證的問題[7] 。 綜上所述，基因診斷與傳統方法相比，具有更靈敏、准確、快捷的特點，在臨床應用中具有其他診斷方法不可替代的地位，其未來的發展方向是發揮其在疾病預測、預防和個體化治療中的作用；同時必須關注基因診斷在醫學倫理和生物安全問題，並加強基因診斷技術的質量控制。
基因診斷方法與傳統的診斷方法相比，有著顯著的優越性，它以基因的結構異常或表達異常為切入點，而不是從疾病的表型開始，因此往往在疾病出現之前就可作出診斷，為疾病的預防和早期及時治療贏得了時間。另外，遺傳病基因變異在全身各處細胞中均能一致體現，診斷取材極為方便，血液細胞及羊水脫落細胞等均可作為診斷材料，而不需要對某一特殊的組織或器官進行檢測。由於以上這些優點，基因診斷從發展伊始就受到了人們的高度重視和普遍歡迎，已應用於許多臨床疾病的診斷。

1 基因診斷在感染性疾病中的應用

基因診斷具有高度的敏感性和特異性，且簡便、快捷，因此在病毒、細菌、支原體、衣原體、立克次體及寄生蟲感染診斷中得到了廣泛應用。（1）人乳頭瘤病毒的檢測:HPV（雙鏈DNA病毒）難以用傳統病毒培養和血清學技術檢測，用核酸雜交、PCR等基因診斷方法則可迅速准確地檢出HPV感染並同時進行分型。（2）肝炎病毒的檢測:HBV（乙型肝炎病毒）的血清學檢測方法已廣泛地應用於臨床，但其測定的只是病毒的抗原成分和機體對HBV抗原的反應，基因診斷則可直接檢測病毒本身，有其獨特的優越性。首先，它高度敏感，可在血清學方法陽性之前就獲得診斷，這在獻血員的篩選中尤為重要，基因診斷方法可將HBV、HCV（丙型肝炎病毒）、HIV（人類免疫缺陷病毒）的窗口期分別由血清學方法60、70、40天縮短到49、11和15天，在防止輸血後肝炎的發生中有著重大的意義。其次，基因診斷可對患者血中的病原體定量檢測，對臨床評價抗病毒治療效果，指導用葯，明確病毒復制狀態及傳染性有重要價值。如我科引進的定量PCR儀，應用實時在線檢測反應管中的熒光信號變化進行病原體DNA的定量，結果更為准確可靠，產物檢測始終在密閉狀態下進行，有效地解決了產物污染這一難題。基因診斷還可檢出病毒變異或因機體免疫狀態異常等原因不能測出相應抗原和抗體的病毒感染。（3）結核桿菌的檢測:結核病是長期以來嚴重威脅人類，特別是發展中國家人民生命健康的常見病，傳統的實驗室診斷依賴痰塗片鏡檢和結核桿菌的培養與鑒定，但陽性率不高，所需時間長。目前應用PCR技術建立診斷方法，敏感度可達到少至100個細菌的水平，且應用針對在結核分枝桿菌中拷貝存在的特異性重復序列引物，既使菌株發生變異，也能准確檢出。（4）基因診斷尚可用於HIV、人類巨細胞病毒（HCMV）、EB病毒、淋病奈瑟氏菌、幽門螺桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、螺旋體及瘧原蟲、弓形蟲等的檢測，無不具有靈敏、特異，能反應現行感染的優點 ［1］ 。

2 基因診斷在遺傳病中的應用 ［2］

基因診斷本身是在分子遺傳學的基礎上發展起來的，在遺傳病的診斷方面成績最為突出，也最有發展前途，對許多已明確致病基因及其突變類型的遺傳病診斷效果良好。即使不明確致病基因，也可利用遺傳標志進行連鎖分析來 診斷某些遺傳病。現在已實現基因診斷的遺傳病已不下百種，這里僅舉幾例加以說明。（1）血紅蛋白病的基因診斷:大多數α地中海貧血是由於α珠蛋白基因缺失所致，應用DNA限制性內切酶酶譜分析法，或用PCR檢測α珠蛋白基因有無缺失及其mRNA水平的方法進行診斷。（2）苯丙酮尿症的診斷:苯丙酮尿症是一種常見的常染色體隱性遺傳病，其病因的分子基礎是苯丙氨酸羥化酶基因點突變，可針對突變的類型應用PCR方法與RFLP（限製片段長度的多態性分析）聯合檢測。（3）杜氏肌營養不良症:約65%的杜氏肌營養不良症患者有X染色體Xp 21.22-21.3 區抗肌萎縮蛋白基因內部DNA片段的缺失和重復，由此導致移碼突變，用針對Xp 21 區各不同部分的多種DNA探針，內切酶酶譜分析，多重PCR等方法均可診斷出抗肌萎縮蛋白基因的異常。

3 基因診斷在腫瘤學中的應用

腫瘤是一類多基因病，其發展過程復雜，臨床表現多樣，涉及到多個基因的變化並與多種因素有關，因而相對於感染性疾病及單基因遺傳病來說，腫瘤的基因診斷難度更大得多。但腫瘤的發生和發展從根本上離不開基因的變化 ，所以基因診斷在腫瘤疾病中也會有廣闊的前景。其重要表現有以下幾方面。（1）腫瘤的早期診斷及鑒別診斷。（2）腫瘤的分級、分期及預後的判斷。（3）微小病灶、轉移灶及血中殘留癌細胞的識別檢測。（4）腫瘤治療效果的評價。另外檢查癌基因的變化不但有助於對腫瘤的診斷和預後，在判斷手術中腫瘤切除是否徹底、有無周圍淋巴結轉移方面也很有優勢。在白血病診斷方面，PCR陽性診斷結果可比傳統的細胞學方法及臨床症狀出現早5～8個月，可檢出1×10 6 個有核細胞中的一個白血病細胞，在白血病的早期診斷、早期治療及臨床化療後殘留白血病的監測方面有著其它方法無可比擬的特異性和敏感性。基因診斷不是萬能的，它只是現代檢驗醫學的非常重要、非常有前景的一種手段。縱觀目前基因診斷的臨床應用現狀，除了病原體的PCR檢測得到了一定程度的應用外，其它領域的應用非常有限，即使在條件較好的三級甲等醫院開展的項目也不多。

㈡ 基因診斷有哪些技術

基因診斷又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學的技術，直接檢測出分子結構水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷
常用技術
綜述
當細胞的基因組DNA用特定的內切酶如Eco RⅠ切割時， 基因診斷凡有GAATTC的地方都被切開，得到許多長度一定但互不相等的片段，需要分析、分離的基因或DNA片段就在其中某一特定的的片段上。 然而許多長短不同的DNA片段混合在一起是很難分析的。因此首先必需將它們按大小（長短）分離開來，這可藉助凝膠電泳來完成。在電泳時，分子量愈小的片段的遷移愈快，愈大的片段愈慢。因此，在電泳結束時可以獲得一個由大到小連續的帶譜（smear），而由許多細胞基因組得來的某一特定片段，因其長度相同將處於同一位置，有利於檢出。但凝膠易碎且操作不便。英國科學家Southern首創印跡法克服了上述困難。
Southern印跡法
Southernblot的基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。 當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。 分子雜交是基因探測的基礎，除了用印跡雜交外，還有斑點雜交法。即將DNA樣品變性後直接點在硝酸纖維濾膜上，再與探針雜交，或者將細胞或病毒點在膜上，菌落或菌斑原位地吸附在膜上，經過變性處理，再進行雜交。斑點雜交多用於病原體基因，如微生物的基因，但也可用於檢查人類基因組中的DNA序列。
聚合酶鏈反應
近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。 首先應按照欲檢測的DNA的5』和3』端的鹼基順序各合成一段長約17－20餘個鹼基的寡核苷酸作為引物（primer），其次是將待檢測的DNA變性後，加入四種單核苷酸（dNTP）、引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴增的DNA鏈復性結合，然後的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成了兩條雙鏈。若繼續按照變性（92－95℃）→復性（40－60℃）→引物延伸（65－72℃）的順序循環20至40個周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環20周期可使DNA擴增2n，即100餘萬倍。PCR反應特異性強，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴增的模板得到大量的擴增片段。毛發、血痕，甚至單個細胞的DNA即可供PCR擴增之用。因此它用於病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細胞的檢出、罪犯或個體遺傳物質的鑒定以及遺傳病的基因診斷等。 已可對一系列的遺傳病進行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如α地貧），則在缺失兩端設計一對引物進行擴增，就不會得到擴增產物或只能得到縮短了的擴增產物。如果疾病是由點突變引起的，而突變的位置和性質已知，則在設計引物時使之包括突變部位，由於突變後的鹼基不配對，結果無擴增片段；或者在引物設計時於其3』端設計一個錯誤的核苷酸，使之與突變了的核苷酸配對，其結果是正常引物不能擴增，而用錯誤的引物能擴增，從而可對突變的存在作出判斷。 PCR技術目前有許多新的發展，用途日益擴大。例如，可用RNA為模板經過逆轉錄再行擴增的RT－PCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結果得到大量單鏈產物，稱為不對稱PCR，其單鏈產物可用於序列分析；在一個反應中加入多對引物同時檢測多個部位的多重PCR等等。
擴增片段長度
多態性小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析。
等位基因的特異
寡核苷酸探針診斷法當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來。 PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。
單鏈構象多態性診斷法
單鏈構象多態性（signlestrand conformation polymorphism，SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。 PCR－SSCP法具有能快速、靈敏地檢測有無點突變或多態性的優點，但如欲闡明突變的鹼基性質，則需作序列分析。

㈢ 研究人類遺傳學常用的方法有哪些

人類遺傳學的主要研究方法是：
①系譜分析。用於研究決定人類性狀或疾病的基因的傳遞規律。
②數理統計。通過群體的調查和系譜分析並將獲得的資料經過數學處理，可以測定人類某些性狀或疾病基因的分布頻率，了解其傳遞規律及與種族、群體、環境、遷移、婚配方式之間的關系。
③細胞遺傳學方法。染色體技術和人類性染色質（X染色質和Y染色質）的研究結果可廣泛應用於染色體異常疾病的診斷、性別鑒定、產前診斷和遺傳咨詢等。醫學細胞遺傳學的研究為人類遺傳學積累了大量的資料（見核型）。
④體細胞遺傳學方法。在人類基因定位中得到廣泛的應用，也常應用於腫瘤遺傳學的研究。
⑤生物化學方法。層析、電泳、色譜分析 、同位素示蹤等被廣泛應用於先天性代謝缺陷、血紅蛋白異常和各種綜合征的研究。這些方法非但可應用於出生後成長過程中的個體，也可以應用於孕婦羊水及其脫屑細胞的產前診斷，以便在孕期中就去除先天性代謝異常的胎兒，這對預防遺傳疾病有重要意義。
⑥免疫學方法。人類體細胞免疫學特性的研究是人類遺傳學的重要內容。它為同種異體臟器的移植提供了理論基礎，同時也可揭示它與某些遺傳性疾病發生的關聯。並為闡明免疫球蛋白的多樣性來源問題開辟了新的途徑。
⑦雙生兒法。通過雙生兒之間的異同對比研究遺傳和環境對個體表型的相對效應的方法，它是人類遺傳學研究中的經典方法。

㈣ 遺傳學的學科有哪些，包括DNA的學科嗎

遺傳學（Genetics）是一門學科，研究生物起源、進化與發育的基因和基因組結構、功能與演變及其規律等，是生物學的一個重要分支，經歷了孟德爾經典遺傳學、分子遺傳學和如今系統遺傳學的研究時期。

遺傳學中的親子概念不限於父母子女或一個家族，還可以延伸到包括許多家族的群體，這是群體遺傳學的研究對象。遺傳學中的親子概念還可以以細胞為單位，離體培養的細胞可以保持個體的一些遺傳特性，如某些酶的有無等。對離體培養細胞的遺傳學研究屬於體細胞遺傳學。遺傳學中的親子概念還可以擴充到DNA脫氧核糖核酸的復制甚至mRNA的轉錄，這些是分子遺傳學研究的課題。基因相互作用與信號傳導網路的系統生物學研究是系統遺傳學的內容。

由一個受精卵產生的免疫活性細胞能夠分別產生各種不同的抗體球蛋白，這也是遺傳學的一個課題，它的研究屬於免疫遺傳學。

從噬菌體到人，生物界有基本一致的遺傳和變異規律，所以遺傳學原則上不以研究的生物對象劃分學科分支。人類遺傳學的劃分是因為研究人的遺傳學與人類的幸福密切相關，而系譜分析和雙生兒法等又幾乎只限於人類的遺傳學研究。

微生物遺傳學的劃分是因為微生物與高等動植物的體制很不相同，因而必須採用特殊方法進行研究。此外，還有因生產意義而出現的以某一類或某一種生物命名的分支學科，如家禽遺傳學、棉花遺傳學、水稻遺傳學等。

更多的遺傳學分支學科是按照所研究的問題來劃分的。例如，細胞遺傳學是細胞學和遺傳學的結合；發生遺傳學所研究的是個體發育的遺傳控制；行為遺傳學研究的是行為的遺傳基礎；免疫遺傳學研究的是免疫機制的遺傳基礎；輻射遺傳學專門研究輻射的遺傳學效應；葯物遺傳學則專門研究人對葯物反應的遺傳規律和物質基礎，等等。

從群體角度進行遺傳學研究的學科有群體遺傳學、生態遺傳學、數量遺傳學、進化遺傳學等。這些學科之間關系緊密，界線較難劃分。群體遺傳學常用數學方法研究群體中的基因的動態，研究基因突變、自然選擇、群體大小、交配體制、遷移和漂變等因素對群體中的基因頻率和基因平衡的影響；生態遺傳學研究的是生物與生物，以及生物與環境相互適應或影響的遺傳學基礎，常把野外工作和實驗室工作結合起來研究多態現象、擬態等，藉以驗證群體遺傳學研究中得來的結論；進化遺傳學的研究內容包括生命起源、遺傳物質、遺傳密碼和遺傳機構的演變以及物種形成的遺傳基礎等。物種形成的研究也和群體遺傳學、生態遺傳學有密切的關系。

從應用角度看，醫學遺傳學是人類遺傳學的分支學科，它研究遺傳性疾病的遺傳規律和本質；臨床遺傳學則研究遺傳病的診斷和預防；優生學則是遺傳學原理在改良人類遺傳素質中的應用。生統遺傳學或數量遺傳學的主要研究對象是數量性狀，而農作物和家畜的經濟性狀多半是數量性狀，因此它們是動植物育種的理論基礎。