關鍵性技術是什麼

❶ 申請專利報告書中創新點技術關鍵和主要技術指標有什麼區別

關鍵技術創新點是指該技術的核心創新點，而技術指標是指達到的技術參數指標且可衡量的，比如你發明的一款新能源電池，其關鍵的創新點指與其他新能源電池有什麼區別，技術指標是摜技術上的參數，如電池的容量、續航時間等指標。

資料補充:

創新點與關鍵性技術之間的不同。

第一個不同點：關鍵性技術項目在研發過程中，需要突破的關鍵性技術，所以它一定是在描述技術，創新點是代表著這個項目創新的亮點，它涵蓋的有：結構創新、技術創新、理論創新、配方創新、應用創新、運營模式創新等，也就是說創新點寫的是項目創新亮點，不一定就是描述技術。

第二個不同點：關鍵性技術是在實現某一功能模塊或者某一技術下需要攻破的關鍵點，可能一個核心技術對應多個關鍵性技術。而創新點是表現出這個項目在核心技術上的有益效果，就是我們說的節能環保、節省成本、提高效益、增強精度等，它一定是帶有有益效果的，所以創新點的寫法常見就是比較法.

關鍵性技術與技術路線之間的不同。

先講下他們的定義不同，關鍵性技術上面講了，是對研發過程中需要突破的關鍵點形成的技術或者中間產物，而技術路線則是整個產品從研發到實現的過程，還有就是技術路線分為產業化技術路線與研發技術路線，之間略有不同，產業化技術路線，突出整個產品從研發到生產的過程，而研發技術路線則是針對某幾個核心技術研發到實現的技術路線。

所以技術路線，是跟研發生產工藝、技術參數放在一起的，因為整個技術工藝就是產品生產技術路線的過程，當然技術路線也不僅僅只有研發生產工藝與技術參數兩點內容.

❷ 物聯網有哪些關鍵性的技術呢

物聯網關鍵應用技術有：
1、感測器技術，這也是計算機應用中的關鍵技術。在目前為止絕大部分計算機處理的都是數字信號。自從有計算機以來就需要感測器把模擬信號轉換成數字信號計算機才能處理。
2、RFID標簽也是一種感測器技術，RFID技術是融合了無線射頻技術和嵌入式技術為一體的綜合技術，RFID在自動識別、物品物流管理有著廣闊的應用前景。
3、政府應該加大對產業的投入，這個投入可以不是資金，而是給企業更多的政策，特別是在操作系統、開發工具、IC設計等產業鏈中高端領域上從政策到資金都要加大投入。在管理上引入重大資金投向問責制，對長期投入資金不能市場化、產業化的項目，定期論證評估，不能達標的關停並轉甚至要追究責任。
4、減少盲目引進項目，在嵌入式與物聯網的發展中，核心技術堅持鼓勵國產化，從資金上、稅收上加大力度向自主研發產品傾斜。杜絕盲目引進產業鏈的中高端技術，特別是不能出現像其他行業一樣，重復引進同一個外國品牌多條生產線的狀況。
這樣可以么？

❸ 雲計算關鍵技術是什麼

雲計算的關鍵技術有三大點：
⑴虛擬化技術：雲計算的虛擬化技術不同於傳統的單一虛擬化，它是涵蓋整個IT架構的，包括資源、網路、應用和桌面在內的全系統虛擬化，它的優勢在於能夠把所有硬體設備、軟體應用和數據隔離開來，打破硬體配置、軟體部署和數據分布的界限，實現IT架構的動態化，實現資源集中管理，使應用能夠動態地使用虛擬資源和物理資源，提高系統適應需求和環境的能力。
對於信息系統模擬，雲計算虛擬化技術的應用意義並不僅僅在於提高資源利用率並降低 成本，更大的意義是提供強大的計算能力。眾所周知，信息系統模擬系統是一種具有超大計算量的復雜系統，計算能力對於系統運行效率、精度和可靠性影響很大，而虛擬化技術可以將大量分散的、沒有得到充分利用的計算能力，整合到計算高負荷的計算機或伺服器上，實現全網資源統一調度使用，從而在存儲、傳輸、運算等多個計算方面達到高效。
⑵分布式資源管理技術：信息系統模擬系統在大多數情況下會處在多節點並發執行環境中，要保證系統狀態的正確性，必須保證分布數據的一致性。為了分布的一致性問題，計算機界的很多公司和研究人員提出了各種各樣的協議，這些協議即是一些需要遵循的規則，也就是說，在雲計算出現之前，解決分布的一致性問題是靠眾多協議的。但對於大規模，甚至超大規模的分布式系統來說，無法保證各個分系統、子系統都使用同樣的協議，也就無法保證分布的一致性問題得到解決。雲計算中的分布式資源管理技術圓滿解決了這一問題。Google公司的Chubby是最著名的分布式資源管理系統，該系統實現了Chubby服務鎖機制，使得解決分布一致性問題的不再僅僅依賴一個協議或者是一個演算法，而是有了一個統一的服務(service)。
⑶並行編程技術：雲計算採用並行編程模式。在並行編程模式下，並發處理、容錯、數據分布、負載均衡等細節都被抽象到一個函數庫中，通過統一介面，用戶大尺度的計算任務被自動並發和分布執行，即將一個任務自動分成多個子任務，並行地處理海量數據。

❹ 名詞解釋：技術關鍵怎麼解釋「技術關鍵」這個名詞

亦稱"關鍵動作"。動作技術中至關重要的部分，它是掌握動作技術、提高運動成績起決定作用的環節。如跳遠技術中的起跳。在體育教學與訓練中都需要狠抓這個動作關鍵。

關鍵技術是指在一個系統或者一個環節或一項技術領域中起到重要作用且不可或缺的環節或技術，可以是技術點，也可以是對某個領域起到至關重要作用的知識。

❺ 保護性耕作的關鍵技術是什麼

保護性耕作主要包括四項關鍵技術：一是改鏵式犁翻耕土壤的傳統耕作方式為免耕或少耕。免耕就是除播種之外不進行任何耕作，少耕包括深松與表土耕作。深松可以疏鬆深層土壤，基本上不破壞土壤結構和地面植被，可提高天然降雨入滲率，增加土壤含水量。二是將30%以上的作物秸稈、殘茬覆蓋地表，在培肥地力的同時，用秸稈蓋土，根茬固土，保護土壤，減少風蝕、水蝕和水分無效蒸發，提高天然降雨利用率。三是採用免耕播種，在有殘茬覆蓋的地表實現開溝、播種、施肥、施葯、覆土、鎮壓復式作業，簡化工序，減少機械進地次數，降低成本。四是改翻耕滅草為噴灑除草劑或機械表土作業控制雜草。

❻ 先進製造技術包含哪些關鍵性技術

先進製造技術在傳統製造技術基礎上不斷吸收機械，電子，信息技術，材料，能源和現代管理等方面的成果,並將其綜合應用於產品設計，製造，檢測，管理，銷售，使用，服務，乃至回收的全過程,以實現優質，高效，低耗，清潔，靈活的生產,提高對動態多變的市場的適應能力和競爭能力的製造技術總稱。

1.先進製造技術涉及到產品從市場調研、產品開發及工藝設計、生產准備、加工製造、售後服務等產品壽命周期的所有內容，它的目的是提高製造業的綜合經濟效益和社會效益，是面向工業應用的技術。

2.先進製造技術強調計算機技術、信息技術、感測技術、自動化技術、新材料技術和現代系統管理技術在產品設計、製造和生產組織管理、銷售及售後服務等方面的應用。它駕馭生產過程的物質流、能量流和信息流，是生產過程的系統工程。

3.80年代以來，隨著全球市場競爭越來越激烈，先進製造技術要求具有世界先進水平，它的競爭已經從提高勞動生產率轉變為以時間為核心的時間、成本和質量的三要素的競爭，因此它是面向全球競爭的技術。

4.先進製造技術的最新發展階段保持了過去製造技術的有效要素，同時吸收各種高新技術成果，滲透到產品生產的所有領域及其全部過程，從而形成了一個完整的技術群，具有面向21世紀新的技術領域。

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先進製造技術包括兩個基本部分:有關產品設計技術和工藝技術。

⑴面向製造

面向製造的設計技術群系指用於生產准備（製造准備）的工具群和技術群。設計技術對新產品開發生產費用、產品質量以及新產品上市時間都有很大影響。產品和製造工藝的設計可以採用一系列工具，例如計算機輔助設計（CAD）以及工藝過程建模和模擬等，生產設施、裝備和工具，甚至整個製造企業都可以採用先進技術更有效地進行設計。近幾年發展起來的產品和工藝的並行設計具有雙重目的，一是縮短新產品上市的周期，二是可以將生產過程中產生的廢物減少到最低程度，使最終產品成為可回收、可再利用的，因此對實現面向保護環境的製造而言是必不可少的。

⑵製造工藝

製造工藝技術群是指用於物質產品（物理實體產品）生產的過程及設備。例如，模塑成形、鑄造、沖壓、磨削等。隨著高新技術的不斷滲入，傳統的製造工藝和裝備正在產生質的變化。製造工藝技術群是有關加工和裝配的技術，也是製造技術或稱生產技術的傳統領域。

先進製造技術（Advanced Manufacturing Technique，縮寫AMT），AMT是中國1995年列入為提高工業質量及效益的重點開發推廣項目，該技術廣涉信息、機械、電子、材料、能源、管理等方面的知識。因此，該技術的發展對推動國民經濟的發展有著重要的作用。

❼ 物聯網三個層次中每個層次有哪些關鍵性技術

在物聯網應用中有三項關鍵技術：

1、感測器技術，這也是計算機應用中的關鍵技術。大家都知道，到為止絕大部分計算機處理的都是數字信號。自從有計算機以來就需要感測器把模擬信號轉換成數字信號計算機才能處理。

2、RFID標簽也是一種感測器技術，RFID技術是融合了無線射頻技術和嵌入式技術為一體的綜合技術，RFID在自動識別、物品物流管理有著廣闊的應用前景。

3、嵌入式系統技術是綜合了計算機軟硬體、感測器技術、集成電路技術、電子應用技術為一體的復雜技術。經過幾十年的演變，以嵌入式系統為特徵的智能終端產品隨處可見；小到人們身邊的MP3,大到航天航空的衛星系統。嵌入式系統正在改變著人們的生活，推動著工業生產以及國防工業的發展。如果把物聯網用人體做一個簡單比喻，感測器相當於人的眼睛、鼻子、皮膚等感官，網路就是神經系統用來傳遞信息，嵌入式系統則是人的大腦，在接收到信息後要進行分類處理。這個例子很形象的描述了感測器、嵌入式系統在物聯網中的位置與作用

❽ 研究內容和關鍵技術的區別

研究內容和關鍵技術的區別：

1、概念不同：關鍵性技術項目在研發過程中，需要突破的關鍵性技術，所以它一定是在描述技術，研究內容是代表著這個項目創新的亮點，它涵蓋的有結構創新、技術創新、理論創新、配方創新、應用創新、運營模式創新等，也就是說創新點寫的是項目創新亮點，不一定就是描述技術。

2、成效不同：關鍵性技術是在實現某一功能模塊或者某一技術下需要攻破的關鍵點，可能一個核心技術對應多個關鍵性技術。而研究內容是表現出這個項目在核心技術上的有益效果，就是我們說的節能環保、節省成本、提高效益、增強精度等，它一定是帶有有益效果的。

概念解析

關鍵性技術主要對核心技術形成過程中產生的關鍵性突破點，這個產物不一定是創新點，但是確實核心的關鍵。研發內容是提出實現整個研發過程需要重點突出的研發點。

這個研發點往往是為了實現總體技術框架而羅列的，所以研發內容是一個整體概念，是對整個研發過程的整體性概述，往往會有一個總體技術框架圖來方便專家理解。

❾ pcr的關鍵性技術

一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶
PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或採用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或塗抹帶
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物
1)克隆PCR產物的最優條件是什麼？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什麼對照實驗？
A）塗布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上帶有氨苄抗型的質粒，或產生氨苄抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用於100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul後，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u後含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標准好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什麼問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適於連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利於連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，後者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低於93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
1.PCR反應的最適條件
4．1 TaqDNA聚合酶
在早期進行的PCR反應中，使用的是大腸桿菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌體T4 DNA聚合酶。這兩種酶的共同弱點是對熱不穩定性，DNA合成反應只能在370C進行。PCR時每一循環的解鏈溫度都在90C以上進行，故在每兩個循環之間要加入新的DNA聚合酶，使得整過程整個實驗過程很繁瑣和昂貴。同時在370C，引物與DNA模板之間會發生分子非特異性結合，最終導致很多非特異性DNA片段的擴增。
Taq 酶有耐高溫的特性，其最適的活性溫度是720C（75-80），連續保溫30分鍾仍具有相當的活性，而且在比較寬的溫度范圍內都保持著催化DNA合成的能力，一次加酶即可滿足PCR操作過程自動化的實現。
（1） TaqDNA聚合酶的熱穩定性及最適延伸溫度
相對分子質量為94000的TaqDNA聚合酶的酶活性較高，大約為200000Umg，在合成時有一個較高的最適溫度75-80C，轉換數Kcat接近150nt/(s•酶分子)。這種活性有明顯的溫度依賴性。TaqDNA聚合酶雖然在90C以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩定。有人試驗證明在92.5C,95C,和97.5C時，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經130分鍾、40分鍾和5-6分鍾後仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環時上限溫度為95C（試管內）處理20秒，則循環50次後TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最適延伸溫度在75-80C時，dNTP的摻入速度為35-100nt/(•酶分子),最長延伸長度7。6kb，如對M13上的富含GC的30-me引物，該酶在70C的延伸率高於60nt/(•酶分子), 在55C仍有較高的延伸活性，22C和37C時延伸速度分別為0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可見，在低溫下，TaqDNA聚合酶一表現活性明顯降低，因而，導致此酶在模板鏈分子內局部二級結構區域的延伸能力受損或前進速率常數與解離常數的比值發生改變。在很高的溫度（90C以上）時，很少DNA合成。在體外條件下，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈的雙鏈結構穩定性的限制。溫度對TaqDNA聚合酶活性的影響見表。
由於TaqDNA聚合酶的最適延伸溫度高達75-80C，故退火和延伸反應溫度均可提高，限制了非特異性擴增產物的出現，增加了PCR的特異性。

4．2 模板
（1） 模板的純度 一般不要求很高，不需要達到超純。某些擴增實驗中甚至可以直接將溶細胞液煮沸加熱，用蛋白質變性後的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影響擴增反應的物質存在，例如蛋白酶、核酸酶、結合DNA的蛋白質等；另一類是尿素、十二烷基硫酸鈉、卟啉類物質等；還有一類是二價金屬離子的絡合劑（如EDTA）等，會與Mg2+絡合，影響Taq DNA聚合酶的活性。上述物質的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。
（2） 模板DNA的量 一般對於單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應體系中有100ng的模板已足夠。有時，加的模板太多，會令擴增失敗。這時如果對模板稀釋後再加入反應體系中，往往能獲得成功。
4．3 dNTP
dNTP儲備液必須為PH7.0左右,濃度一般為2mmol/L, 分裝後置-20C保存.典型的PCR擴增體系中,兩種dNTP的終濃度為20-200umol/L. 理論上,100ul反應液中兩種dNTP的濃度為20umol/L時,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP會絡合溶液中的 Mg2+, 而且大於200umol/L的dNTP會增加Taq DNA聚合酶的錯配率.如果dNTP的濃度達到1mmol/L時,則會抑制Taq DNA聚合酶活性.
4．4 Mg2+濃度
Taq DNA聚合酶在合成新DNA鏈時,要求有游離的Mg2+,因而在PCR系統中確定Mg2+的最適濃度是必要的. Mg2+濃度太低會無PCR產物,太高又會導致非特異的產物產生. 故常需根據各自的實驗預先試驗,以確定本實驗的最佳Mg2+濃度,保證DNA聚合酶具有良好的活性.
通常情況下,要求反應體系中有0.5-2.5mmol/L的游離Mg2+.反應內容物中, dNTP能與Mg2+.結合,所含EDTA會與Mg2+絡合,高濃度的DNA也有干擾作用,都會影響Mg2+的有效濃度.
4．5 PCR系統中的其它成分
PCR反應緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是兩性離子緩沖劑.此外,還有50 mmol/L KCL, 它有利於引物與模板退火.高於50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl對Taq DNA聚合酶有抵製作用.明膠或血清白蛋白(100ug/ml)及非離子去污劑,如Tween20等,對Taq DNA聚合酶起穩定作用.
4．6 PCR的熱循環計劃
在標准反應中,將標本加熱至90-95C,使DNA雙鏈變性, 再快速冷卻至40-60C使引物退火並結合到互補靶序列上,然後升溫至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下摻入單核苷酸使引物沿模板延伸.每步時間從反應達到要求溫度後計算. PCR反應的每一個溫度循環周期都是由DNA變性引物退火和反應延伸3個步驟組成的.圖中設定的反應參數是94C變性1分鍾,60C退火1分鍾,72C延伸1.5分鍾.如此周而復始,重復進行,直到擴增產物的數量滿足實驗需求為止.
(1) 變性溫度與時間 使靶基因模板和PCR產物完全變性是PCR成敗的關鍵.DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鍾,但反應管內達到Tss還需一定時間,變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下94-95C變性1分鍾就足以使模板DNA完全變性,更高的溫度可能更為有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低於94C,則需延長變性時間.為提高起始模板的變性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先變性7-10分鍾,再按94C的變性溫度進入循環方式,這對PCR的成功有益處.
(2) 復性溫度與時間 復性溫度決定著PCR的特異性.引物復性所需的溫度與時間取決於引物的鹼基組成、長度和濃度。合適的復性溫度應低於擴增引物在PCR條件下真實Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,復性溫度越低（40-45C）。一般來說，若降低復性溫度（37C），可提高墳增產量，但引物與模板間錯配現象會增多，導致非特異性擴增上升；若提高復性溫度（56-70C），雖擴增反應的特異性增加，但擴增效果下降。理想的方法是：設置一系列對照反應，以確定擴增反應的最適復性溫度。
（3）延伸溫度與時間 Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度范圍內催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對擴增產物的特異性、產量造成影響。引物延伸溫度一般為72C（較復性溫度高10C左右），延伸時間視目標DNA片段長短和濃度而定。在最適溫度下，核苷酸的摻入率為35-100nt/s，這也取決於緩沖體系、PH值、鹽濃度和DNA模板的性質等，延伸1分鍾對長達2kb的擴增片段是足夠的，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現，但在循環的最後一步延伸時，為使反應完全，提高產量，可將延伸時間延長4-10分鍾。
（4）循環數 循環數決定著擴增程度，常規PCR一般為25-40周期，在其他參數交已優化的條件下，最適循環數取決於靶序列的初始濃度，其相應關系參照下表
模板DNA分子數 需要熱循環次數
3．0×105 25-30
1．5×104 30-35
1．0×103 35-40
50 40-45
循環次數太少，得不到一定的產物量；循環次數太多時，擴增反應的後期，產物積累的指數率下降甚至不再有正確的產物生成，正常的反應幾乎停止，呈現平台效應。
影響出現平台效應的因素有：
A、反應試劑（dNTP或酶）穩定性的改變；
B、終產物（如焦磷酸）的抑制效應；
C、產物濃度超過10-5時可產生重復退火，於是會降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性
D、高濃度產物DNA雙鏈的解鏈不寶劍。平台效應時的一種重要後果是由於錯誤引導，在開始時濃度不高的非特異產物會繼續擴增，使結果的分析復雜化。
4．3引物的要求：
（1） 一般長15-30bp，常用20bp（理論上420=11×1011長的DNA片段才會有重復）。引物過長，擴增的效率降低。
（2） 鹼基組成：C+G佔50-60%（常規），盡量避免數個嘌呤和嘧啶的連續排列。
（3） 一對引物之間不能有2個以上的鹼基互補，特別是3『末端；引物之間的鹼基互補會形成引物二聚體，引物本身應避免迴文序列。
（4） 引物與模板退火的溫度和所需的時間取決於引物的鹼基組成、長度和溶液中引物的濃度。合適的退火溫度是低於引物本身的實際變性溫度（Tm）50C。20bp左右長度的DNA片段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火溫度通常在55-720C下進行在標準的引物濃度（0.2umol/L）下，幾秒內即可完成退火。提高退火溫度可提高引物與模板結合的特異性。特別在最初幾次循環中採用嚴謹的退火溫度，有助於PCR特異性擴增。如果引物中（G+C）的含量小於50%，退火溫度應低於550C。
（5） 100ul的PCR反應液中，引物的絕對量為10-100pmol。PCR反應液中2個引物濃度不等時，其濃度比為50:1，稱為不對稱PCR。
簡並引物：由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數個核苷酸的差異。若PCR擴增引物的核苷酸組成順序是根據氨基酸順序推測而來，就需合成簡並引物。
嵌套引物：利用第一輪PCR擴增產物作為第二輪PCR擴增的起始材料，同時除使用第一輪的一對特異引物外，另加1-2個新引物（處在同一個模板DNA的頭兩個引物之間序列）進行第二輪擴增。通過嵌套引物擴增的產物，產生錯誤擴增的可能性極小，所以應用嵌套引物技術能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增。
PCR的的應用：基因克隆、反向PCR、不對稱PCR、RT-PCR、基因的體外誘變和突變檢測、基因組的比較研究

❿ 什麼是技術關鍵

技術的硬體是工具、機器、設備等。技術的軟體是方法、技巧、模型等
技術的關鍵是科學、實用、方便、有效等。