① DNA分子標記技術有哪幾類
分類不一樣哦,我慢慢打。
一、直接法:熒光素直接標記在探針上,很顯然這個更方便,步驟少啊。
間接法:通過化學法或酶法在探針上引入一個標記物,如DIG,Biotin等半抗原,然後通過免疫親和作用,引入熒光素信號。這個信號會好,但是步驟比較多。
二 、另一個分類:非酶標記和酶法標記,不過現在酶法標記很常用了,因為快速方便且檢測方法都在突飛猛進......
酶法標記
1 Klenow進行隨機引物標記 優點不少,核苷酸標記物摻入綠比較高,有效標記DNA量也多,標記100-500bp最好,產量可能要比缺口平移法少一些。
2 DNA Pol I / DNase I進行缺口平移標記 基本都是大片段標記1000以上的,這種方法生產常見,成本低且易操作,快速,信號可能低一點。上面這倆方法現在大片段探針標記常用.
3 PCR 方法進行標記(Taq DNA Polymerase,/Pwo DNA Polymerase or Expand),這個常見了,特點就是高特異性,小片段能有很好的標記效果,一個兩個鹼基都可以檢測,就是設計引物非常麻煩,可已查到很多相關文獻。
4 寡核苷酸3´-標記或用末端轉移酶加尾標記DNA,這個是在探針3'端形成一個尾巴,可以加上其他片段產生高比活性的探針,一般用於克隆序列堅定和基因組DNA樣品的點突變檢測和原位雜交。
5 用SP6-, T3- or T7 RNAPolymerases*進行體外轉錄標記RNA,這個是標記RNA探針的,但是可用於轉錄DNA質粒的制備,商品上常用,所以我就列上了
其他RNA探針標記不寫了,還有一個用AMV/M-MuLV合成cDNA,也是逆轉錄,但是這個我不大了解,抱歉。
三 還有一個分類是安標記物分的,放射性核算標記和非放射性核算標記。
放射性核算標記可通過放射自顯影使其標記的探針得到檢測。
非放射性的:1鹼性磷酸酶AKP顯示系統。2辣根過氧化物酶HRP顯示系統。3 ABC顯示系統:abc是親和素-生物素-酶復合物,酶也是選用AKP\HRP,然後各自的酶的顯色系統顯示。這三種均為顯色反應。
就知道這些,不知是否有用
② DNA技術可應用於哪些領域
很多,如基因工程,環境檢測,環境凈化,農業,畜牧業,食品業,葯品和基因治療,克隆等。
【DNA重組技術的發展】
20世紀50年代,DNA雙螺旋結構被闡明,揭開了生命科學的新篇章,開創了科學技術的新時代。隨後,遺傳的分子機理――DNA復制、遺傳密碼、遺傳信息傳遞的中心法則、作為遺傳的基本單位和細胞工程藍圖的基因以及基因表達的調控相繼被認識。至此,人們已完全認識到掌握所有生物命運的東西就是DNA和它所包含的基因,生物的進化過程和生命過程的不同,就是因為DNA和基因運作軌跡不同所致。
知道DNA的重大作用和價值後,生命科學家首先想到能否在某些與人類利益密切相關的方面打破自然遺傳的鐵律,讓患病者的基因改邪歸正以達治病目的,把不同來源的基因片段進行「嫁接」以產生新品種和新品質……於是,一個充滿了誘惑力的科學幻想奇跡般地成為現實。這是發生在20世紀70年代初的事情。
實現這一科學奇跡的科技手段就是DNA重組技術。1972年,美國科學家保羅?伯格首次成功地重組了世界上第一批DNA分子,標志著DNA重組技術――基因工程作為現代生物工程的基礎,成為現代生物技術和生命科學的基礎與核心。
DNA重組技術的具體內容就是採用人工手段將不同來源的含某種特定基因的DNA片段進行重組,以達到改變生物基因類型和獲得特定基因產物的目的的一種高科學技術。
到了20世紀70年代中後期,由於出現了工程菌以及實現DNA重組和後處理都有工程化的性質,基因工程或遺傳工程作為DNA重組技術的代名詞被廣泛使用。現在,基因工程還包括基因組的改造、核酸序列分析、分子進化分析、分子免疫學、基因克隆、基因診斷和基因治療等內容。可以說,DNA重組技術創立近 30多年來所獲得的豐碩成果已經把人們帶進了一個不可思議的夢幻般的科學世界,使人類獲得了打開生命奧秘和防病治病「魔盒」的金鑰匙。
目前,DNA重組技術已經取得的成果是多方面的。到20世紀末,DNA重組技術最大的應用領域在醫葯方面,包括活性多肽、蛋白質和疫苗的生產,疾病發生機理、診斷和治療,新基因的分離以及環境監測與凈化。
許多活性多肽和蛋白質都具有治療和預防疾病的作用,它們都是從相應的基因中產生的。但是由於在組織細胞內產量極微,所以採用常規方法很難獲得足夠量供臨床應用。
基因工程則突破了這一局限性,能夠大量生產這類多肽和蛋白質,迄今已成功地生產出治療糖尿病和精神分裂症的胰島素,對血癌和某些實體腫瘤有療效的抗病毒劑――干擾素,治療侏儒症的人體生長激素,治療肢端肥大症和急性胰腺炎的生長激素釋放抑制因子等100多種產品。
基因工程還可將有關抗原的DNA導入活的微生物,這種微生物在受免疫應激後的宿主體內生長可產生弱毒活疫苗,具有抗原刺激劑量大、且持續時間長等優點。目前正在研製的基因工程疫苗就有數十種之多,在對付細菌方面有針對麻風桿菌、百日咳桿菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等的疫苗;在對付病毒方面有針對甲型肝炎、乙型肝炎、巨細胞病毒、單純皰疹、流感、人體免疫缺陷病毒等的疫苗……。我國乙肝病毒攜帶者和乙肝患者多達一二億,這一情況更促使了我國科學家自行成功研製出乙肝疫苗,取得了巨大的社會效益和經濟效益。
抗體是人體免疫系統防病抗病的主要武器之一,20世紀70年代創立的單克隆抗體技術在防病抗病方面雖然發揮了重要作用,但由於人源性單抗很難獲得,使得單抗在臨床上的應用受到限制。為解決此問題,近年來科學家採用DNA重組技術已獲得了人源性抗體,這種抗體既可保證它與抗原結合的專一性和親合力,又能保證正常功能的發揮。目前,已有多種這樣的抗體進行了臨床試驗,如抗HER-2人源化單抗治療乳腺癌已進入Ⅲ期試驗,抗IGE人源化單抗治療哮喘病已進入Ⅱ期試驗。
抗生素在治療疾病上起到了重要作用,隨著抗生素數量的增加,用傳統方法發現新抗生素的幾率越來越低。為了獲取更多的新型抗生素,採用DNA重組技術已成為重要手段之一。目前人們已獲得數十種基因工程「雜合」的抗生素,為臨床應用開辟了新的治療途徑。
值得指出的是,以上所述基因工程多肽、蛋白質、疫苗、抗生素等防治葯物不僅在有效控制疾病,而且在避免毒副作用方面也往往優於以傳統方法生產的同類葯品,因而更受人們青睞。
人類疾病都直接或間接與基因相關,在基因水平上對疾病進行診斷和治療,則既可達到病因診斷的准確性和原始性,又可使診斷和治療工作達到特異性強、靈敏度高、簡便快速的目的。於基因水平進行診斷和治療在專業上稱為基因診斷和基因治療。目前基因診斷作為第四代臨床診斷技術已被廣泛應用於對遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、病毒細菌寄生蟲病和職業病等的診斷;而基因治療的目標則是通過DNA重組技術創建具有特定功能的基因重組體,以補償失去功能的基因的作用,或是增加某種功能以利對異常細胞進行矯正或消滅。
在理論上,基因治療是治本治癒而無任何毒副作用的療法。不過,盡管至今國際上已有100多個基因治療方案正處於臨床試驗階段,但基因治療在理論和技術上的一些難題仍使這種治療方法離大規模應用還有一段很長的距離。不論是確定基因病因還是實施基因診斷、基因治療、研究疾病發生機理,關鍵的先決條件是要了解特定疾病的相關基因。隨著「人類基因組計劃」的臨近完成,科學家們對人體全部基因將會獲得全面的了解,這就為運用基因重組技術造逼於人類健康事業創造了條件。
③ DNA測序可以採用哪些手段,並闡述各自的原理
大約可以分為一下幾種測方法:
1、Sanger 測序,用鏈終止法和毛細管電泳,這個是第一代測序的主要方法,至今仍然在使用。
2、邊合成邊測序:454和Illumina測序都採用的這種方法,不過,有一些區別。454用Emusion PCR, Illumina用 Bridge PCR進行測序文庫構建;454用焦磷酸發應的信號進行檢測,Illumina用熒游標記進行檢測;454一次性加一種dNTP,illumina一次性加4中dNTP,每次反應合成一個鹼基。
3、邊合成邊測序:Life Tech 的SOLiD是這個方法,文庫構建與454基本相同,但是測序反映採用的鏈接酶,每次鏈接一個小片段,編碼方法比較復雜。
4、單分子測序: Pac BioScience目前採用的這個方法,屬於第三代測序技術中比較有潛力的方法。
5、納米孔測序: Oxford Nanopore採用的最新測序技術,是目前最為期待的第三低測序技術,還沒有穩定的儀器和試劑上市。