① 細胞凍存為什麼要進行程序性降溫
一般凍存盒中加入甘油的居多吧。丙二醇，異丙醇加入後，一方面防止由於溶液效應而使細胞脫水及蛋白質變性；另一方面在稍低於溶液冰點時人工強行誘導結冰，以免出現溶液過冷現象，防止結冰時釋放潛熱引起溫度回升，以及形成大的冰晶，減輕對細胞的損傷。在一步冷凍中．選用高濃度的滲透性保護劑組成的玻璃化溶液，在冷凍過程中，不發生結晶而形成玻璃樣固體，維持液態時的正常分子與離子分布，使細胞內發生玻璃化而起到保護作用。
② 化學實驗,用異丙醇和水迴流的作用
異丙醇是常⽤作外⽤酒精主要成分的酒精猜信穗。在許多國家，外⽤酒精是消毒酒精，這種溶液通常包含坦態70%異丙醇或⼄醇，以及30%的蒸餾⽔。這種酒精的液體是變性的，方法是利用程序降溫盒設定程序由室溫降低至-80℃，利用穗卜異丙醇實現梯度降溫，最後再放置到液氮槽中長期保存。
③ 細胞復甦、 換液、傳代、 凍存protocol
復甦
細胞復甦是指將凍存在液氮或-80℃的細胞解凍，恢復其生長的過程。操作原則：快！慢凍速融里的速融就是指細胞復甦過程。
步驟：
1、 准備工作：預熱完全培養基。多少℃培養的細胞就預熱到多少℃
在生物安全櫃/超凈工作台中，准備好細胞培養瓶/皿，並在其中添加足量預熱的完全培養基。
如果需要離心去除凍存細胞中的凍存液，此時也可以准備好 15ml 離心管，在管中添加1-2ml 預熱的完全培養基。
2、 解凍細胞。
做法有 2 種選擇：
(1)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速入 37℃水浴，輕搖解凍。凍存管口保持在水面上，以免水浴鍋中的水進入管中。
如果凍存細胞的地方離細胞房水浴鍋較遠，可以准備一個干凈的燒杯，燒杯中裝 37℃ 水，帶著燒杯去取細胞以實現迅速入水浴，或者路上利用體溫手搓凍存管到達水浴 時如未充分解凍再投入水浴繼續解凍。當凍存管中只剩一點小冰粒時，酒精棉擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。
(2)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速酒精擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/ 超凈工作台，向凍存管內加入適量預熱的完全培養基，並輕輕吹打以促使細胞融化。這個做法適合凍存管中有足夠空間以容納新加入的新鮮培養基。自己可以嘗試一下，哪種方法細胞融化速度快就用哪種方法。個人認為第 2 種快。
3、 接種細胞：
此時做法有 3 種選擇：
(1)如果是對凍存液成分耐受的細胞，可將凍存管中的細胞直接吸入准備好的培養瓶/皿， 輕輕十字搖晃混勻細胞，放入細胞培養箱。
(2)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，將凍存管中的細胞吸入准備好的 15ml 離心管中，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
(3)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，用解凍細胞第 2 種方法的，可以直接用凍存管離心，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
4、 第二天光鏡下觀察細胞。如果是帶著凍存液一起接種的細胞應進行換液。
細胞換液
細胞換液是指去除舊的培養基，換成新的完全培養基以繼續提供細胞充足的營養支持。當舊培養基 ph 值改變（含酚紅的培養基通常是變酸發黃）時，需要及時進行換液。
步驟：
1、 准備工作：
預熱完全培養基，酒精棉擦拭培養基瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開培養基瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。
如果是貼壁細胞，可以用全量換液法，直接吸去全部舊培養基，補充足量新鮮完全培養基。
如果是懸浮細胞，可以用半量換液法，即吸去一半舊培養基，補充新鮮完全培養基。（會損失一半細胞）。懸浮細胞如果不想損失細胞，那就需要將培養物轉移到離心管中，離心去除舊培養基，再用新培養基重懸細胞沉澱。
不光細胞維持培養時需要進行細胞換液，一些實驗操作也需要進行細胞換液。當換液操作是實驗需要時，可能在添加新的培養基前需要 PBS 清洗細胞以去除舊培養基的影響， 新添加的培養基也可根據實驗需求進行特殊配製，不一定是完全培養基。
細胞傳代 是指將細胞培養物分出來，重新接種到新的培養瓶/皿內，使細胞重新獲得足夠的生長空間的過程。
對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行傳代。
預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開試劑瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。
吸去舊的培養基，DPBS 洗細胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或無動物成分來源的 TryplLE），輕輕晃動培養瓶/皿，使消化液能均勻布滿所有細胞。
一些強貼壁的細胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗細胞，並在 37℃進行消化（加上消化液後放進 37℃細胞培養箱）。
用含EDTA 的胰蛋白酶來消化細胞的話，消化速度會更快。
強貼壁細胞或用特殊的無血清培養基培養的細胞使用 TrypLE 消化。
細胞消化的同時可以准備新的培養瓶/皿，往培養瓶/皿中添加適量新鮮培養基。
當鏡下觀察貼壁細胞直接的連接鬆散，細胞有所變形，但還沒有出現大片脫落時，吸去消化液，稍待一兩分鍾，讓殘留在細胞表面但是肉眼看不見的消化液進一步消化。
加入適量完全培養基，輕柔吹打細胞（用一層層「掃描」方式來吹打），不要忘了沿邊「清掃」。胰蛋白酶可以被完全培養基中含的血清終止。
EDTA 無法被終止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的細胞，可以在加完全培養基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。
TrypLE 無需終止，DPBS 稀釋即可，因此也可以在加完全培養基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。
最好控制不要消化過度，細胞成片脫落。當細胞消化過度時，只能通過離心去除消化液了。
吹打細胞時注意輕柔，控制泡沫，以免對細胞造成太多的細胞損傷。吸不凈，吹不凈， 槍尖始終保持在液體中可以有效控制泡沫產生。
在加入新培養基吹打細胞時即可規劃好，打算一盤細胞分成 N 盤，那就用 0.5N/1N ml 培養基進行細胞吹打。
將細胞吹打成細胞懸液後即可每個新瓶/皿接種 0.5 或 1ml，十字混勻後，送入細胞培養箱繼續培養。
通常細胞可以 1:2、1:3、1:4 傳。有些細胞不能傳太稀，容易狀態不好生長緩慢。
對懸浮細胞而言，因為不需要消化，傳代過程比較簡單，直接吸取一定量舊培養物接種到新培養瓶/皿即可。
細胞凍存 主要為了細胞保種，是指將細胞置於保護性液體中於低溫中長期儲存的技術。
對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行凍存。
預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑、DMSO 或無血清細胞凍存液，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。准備無菌細胞凍存管和 15ml 離心管，移入生物安全櫃/超凈工作台。
准備程序凍存盒（恢復至室溫）。如果使用添加異丙醇的程序凍存盒，注意異丙醇的量， 如不足，需添加，並且應該根據程序凍存盒說明書定期更換異丙醇。
按細胞傳代的做法進行細胞消化，吸去消化液後，1-2ml 完全培養基吹打成單細胞懸液。對懸浮細胞而言，無需消化，直接進入下一步離心收集細胞。
將單細胞懸液轉移到 15ml 離心管，500g×3min 離心，去除上清。
如使用無血清細胞凍存液，直接吸取無血清細胞凍存液重懸細胞，然後轉移到凍存管中擰緊蓋子。
如使用自製的細胞凍存液，需要先配製好細胞凍存液，方法如下：
優先使用培養該細胞的新鮮完全培養基配製，900ul 完全培養基+100ul DMSO=1ml 細胞凍存液（DMSO 含量 10%）。
DMSO 在加入培養基時會發熱，務必提前配製好凍存液，以免過熱損傷細胞。
對於嬌弱的細胞，可配成 2×細胞凍存液，先使用一定體積新鮮完全培養基重懸細胞，再逐滴滴加等體積 2×細胞凍存液（DMSO 終濃度還是 10%），吹打混勻，轉移到凍存管中。
自製細胞凍存液中的 DMSO 可適當降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。
在凍存一些比較嬌弱的原代細胞時，凍存液中的完全培養基可以用胎牛血清替代，即凍存液中只含胎牛血清和DMSO。
凍存細胞的量可以參考傳代時的比例，原則是讓復甦的細胞有充足的生長空間。推薦使用內旋式細胞凍存管，比較安全。
有些細胞凍存管的管蓋設計是特殊的，當第一次感覺擰緊時，此時並沒有真正擰緊，可以進一步擰，直到第二次感覺到擰緊。推薦使用這樣的凍存管，在溫度變化發生熱脹冷縮時不容易發生液體泄漏，減少污染的可能性。
使用無血清凍存液重懸的細胞，無需程序降溫，直接塞-80℃冰箱降溫，第二天轉移到液氮中。
使用自配細胞凍存液的細胞，需放進程序凍存盒後再置於-80℃冰箱中，第二天轉移到液氮中。
-80℃不適合長期保存凍存細胞（大概 1-2 年吧）。液氮中凍存的細胞十年之久都可以復甦成功。如需要更長期地保存細胞，應該定期復甦細胞後再次凍存。
程序凍存盒也可以自製，即使用大量脫脂棉花包裹凍存的細胞，或使用海綿包裹細胞。
：