反轉錄程序最後一步多少溫度合適

Ⅰ 反轉錄PCR的操作

1. 總RNA的提取。
2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：如今試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。
（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
然後加入下列試劑的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）於70℃加熱15min以終止反應。
（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：
第一鏈cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（2） 加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。
（3） 設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與准確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。
（4） 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。
（5） 密度掃描、結果分析：採用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

Ⅱ 怎麼確定反轉錄完的CDNA中還有沒有GDNA污染

對於新手來說購買反轉錄試劑盒是比較理想的，買一個kit看看說明書操作就可以了。推薦兩款kit TAKARA和HaiGene，這兩款試劑盒都能對RNA樣品中的gDNA有效去除，因此對RNA質量的要求不高。TAKARA的RR047A操作方便，反轉錄溫度為37℃，對於大多數試驗來講是滿足要求的。HaiGene的D0401操作要多一個步驟，但其反轉錄溫度是55℃（耐高溫的反轉錄酶），提高了反轉錄溫度使得高GC含量、復雜模板、長mRNA的模板都能有效反轉錄，因此其反轉錄效率更高，更能夠獲得樣本中基因的真實表達量。如果後續試驗是RealTime PCR、ORF克隆、高GC含量、或者你的待研究基因結構復雜程度未知，還是選用耐高溫的反轉錄酶更理想。對於反轉錄高手來說，直接購買反轉錄酶、再購買Rnase Inhibitor自己配製反轉錄體系就可以了。對於樣本量大的課題組來講，相對還是比較經濟的。選擇反轉錄酶時僅需要考慮是否需要耐高溫的酶，來克服目的基因的復雜結構就可以了。PROMEGA、TAKARA、HaiGene、 TRANSGEN等品牌的反轉錄酶性價比還都是不錯的。Life、NEB的也不錯，銀子足的也可考慮，不一一解釋了。

Ⅲ rt-pcr逆轉錄的溫度一般設置為多少

1.變性RNA的過程還沒有加入反轉錄酶，請仔細閱讀說明書！
2.反轉錄酶有很多種，針對高GC的RNA反轉，可以加入適量DTT,DMSO,甜菜鹼等降低退火溫度。當然也可以選用耐高溫的反轉錄酶。

Ⅳ 反轉錄酶的注意事項

反轉錄酶
在進行RT反應之前，應考慮以下幾個方面：
1、RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA，高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈cDNA合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經常更換新手套。
2、引物的選擇
OligodT
選擇OligodT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對RNA樣品的質量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第一鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然後進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（<500bp）的增加和長片斷、全長產物產物的降低。
特異性引物
特異性引物只能用你設計引物時的下游引物做RT，引物設計質量影響RT的結果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是最佳選擇，一般不推薦。

Ⅳ mRNA反轉錄形成cDNA的步驟

mRNA反轉錄形成cDNA的步驟如下：
將mRNA置於PCR儀中，經過95度變性、72度延伸、Tm溫度退火，來回30~35個循環，最後4度就能得到反轉錄的cDNA。

Ⅵ rna轉cdna預變性溫度是多少

博凌科為的THERMOscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（第一鏈耐熱反轉錄試劑盒）反轉錄溫度耐受性比較強，效果不錯
本製品使用通過基因重組技術克隆表達的點突變型 RNase H 活性缺失的 M-MuLV 反轉錄酶
THERMOscript Hˉ RTase 。 同時經過多點突變，提高了反轉錄溫度耐受性，可以在 45-55℃進行反轉錄。野生型的 M-MuLV 包含的 RNase H 活性能夠催化降解 DNA\\/RNA 雜合體中的 RNA，因此 在 cDNA 第一 條鏈的 合成 反應中 可能 會降 解 RNA\\/DNA 雜合 體中的 模板 RNA 。 本酶
M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失，與 M-MuLV 相比，具有更強的延伸能力和穩定性，
可用於較長的 cDNA 合成以及高比例的全長 cDNA 文庫的構建等。同時更高的反轉錄溫度大大的
提高了 GC 含量高，二級結構豐富的 RNA 模板的反轉錄效率。

注意事項::
1、 避免RNase污染。
2、為保證反轉錄成功建議使用高質量的RNA樣品。
3、如果RNA模板GC含量豐富或者有復雜二級結構，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混勻，65℃變性5分鍾，冰上冷卻，短暫離心後加入其它成分繼續下面的反轉錄步驟。

Ⅶ 逆轉錄原理

逆轉錄PCR （ RT-PCR ）的原理
逆轉錄PCR (RT-PCR )具有較高的靈敏性、操作簡單等優點，常用於基因定量分析、生物學檢測等，此外常用逆轉錄PCR克隆目的基因。 本文主要講述了逆轉錄PCR的原理、重要參數以及操作注意事項。
cDNA的合成是RT-PCR 的重要環節。以mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，隨機引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導下合成互補的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，則可擴增出不含內含子的可編碼完整基因的序列。
逆轉錄PCR 重要參數
不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同;因此，適合於一種mRNA拷貝的條件可能對另一種mRNA不適合。一般來說，從事不均一mRMA群體時，所使用的條件是導致cDNA合成的終產量達到最大，下述參數十分重要。
1.逆轉錄酶 有兩種不同的逆轉錄酶可以催化以mRNA為模板，oligo(dT)作為引物，合成與mRNA互補的cDNA鏈。一種來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNA酶H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產生也限制其長度。另外，禽源逆轉錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內切酶污染。
另一種來源於鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶H活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。
在第一鏈反應前可用氫氧化甲基汞處理，破壞mRNA的二級結構，這一步對於最適反應溫度較低(37)℃的鼠源逆轉錄酶催化的反應可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑，可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。
2.單價陽離子 離子條件基本上影響各種模板的轉錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長的轉錄產物。對於cDNA長度的最適鉀離子濃度為140-150mM。
3.二價陽離子 對於反轉錄酶活性來說，二價陽離子是必需的。低於4mM Mg2 未能觀察到活性;產生全長轉錄產物的最適濃度是6-10mM。
4.脫氧核苷三磷酸 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對於有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下，全長轉錄物的產量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。
材料與方法

Ⅷ 人在冰棺里多少溫度最合適

人在冰棺里－18℃最合適。

櫃內溫度可達－18℃。冰棺主要應用於屍體的冷藏，因此多被醫院、殯儀館、警察局、甚至是大眾出租。冰棺在其特殊的行業中展現著其特有的作用。

最初我國並沒有冰棺的製造技術，第一個冰棺的引入是在1925年。孫中山先生1925年逝世時，蘇聯政府於1925年3月30日來贈送過一個冰棺（也稱玻璃蓋鋼棺），因孫先生已入殮，所以未使用。至今一直放在香山公園的孫中山紀念堂中。

相關如下：

冰棺材從外觀看包括棺罩和箱體。棺罩是雙層PC耐力板組成。內部飾以模擬鮮花，彩燈環繞。

箱體由外箱體和內箱體組成（外箱體主要有金屬材料製作而成）。

內部製冷系統主要包括壓縮機，冷凝器，蒸發器等部分。三個主要部分的共同工作達到製冷效果，從而保證機器內部溫度低，保證屍體不腐。

Ⅸ RNA逆轉錄升溫程序各階段的作用

高溫是解鏈和滅活反轉錄酶的 長久保存放-20

Ⅹ RNA是如何反轉錄成cDNA的過程和原理怎樣請教

rna不純化做反轉錄，cdna容易降解.
是的，得到的是全體mrna的cdna的庫。然後通過pcr手段獲得需要的目的片段。但是實際操作過程中，由於mrna的降解，因此一次實驗不可能得到全部的cdna,因此要重復1~2次，才能保證全部mrna被反轉錄為cdna.
核糖核酸（縮寫為rna，即ribonucleic
acid），存在於生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。rna由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和鹼基構成。rna的鹼基主要有4種，即a腺嘌呤、g鳥嘌呤、c胞嘧啶、u尿嘧啶，其中，u（尿嘧啶）取代了dna中的t。