⑴ 化學實驗,用異丙醇和水迴流的作用
異丙醇是常⽤作外⽤酒精主要成分的酒精猜信穗。在許多國家，外⽤酒精是消毒酒精，這種溶液通常包含坦態70%異丙醇或⼄醇，以及30%的蒸餾⽔。這種酒精的液體是變性的，方法是利用程序降溫盒設定程序由室溫降低至-80℃，利用穗卜異丙醇實現梯度降溫，最後再放置到液氮槽中長期保存。
⑵ 細胞復甦、 換液、傳代、 凍存protocol
復甦
細胞復甦是指將凍存在液氮或-80℃的細胞解凍，恢復其生長的過程。操作原則：快！慢凍速融里的速融就是指細胞復甦過程。
步驟：
1、 准備工作：預熱完全培養基。多少℃培養的細胞就預熱到多少℃
在生物安全櫃/超凈工作台中，准備好細胞培養瓶/皿，並在其中添加足量預熱的完全培養基。
如果需要離心去除凍存細胞中的凍存液，此時也可以准備好 15ml 離心管，在管中添加1-2ml 預熱的完全培養基。
2、 解凍細胞。
做法有 2 種選擇：
(1)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速入 37℃水浴，輕搖解凍。凍存管口保持在水面上，以免水浴鍋中的水進入管中。
如果凍存細胞的地方離細胞房水浴鍋較遠，可以准備一個干凈的燒杯，燒杯中裝 37℃ 水，帶著燒杯去取細胞以實現迅速入水浴，或者路上利用體溫手搓凍存管到達水浴 時如未充分解凍再投入水浴繼續解凍。當凍存管中只剩一點小冰粒時，酒精棉擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。
(2)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速酒精擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/ 超凈工作台，向凍存管內加入適量預熱的完全培養基，並輕輕吹打以促使細胞融化。這個做法適合凍存管中有足夠空間以容納新加入的新鮮培養基。自己可以嘗試一下，哪種方法細胞融化速度快就用哪種方法。個人認為第 2 種快。
3、 接種細胞：
此時做法有 3 種選擇：
(1)如果是對凍存液成分耐受的細胞，可將凍存管中的細胞直接吸入准備好的培養瓶/皿， 輕輕十字搖晃混勻細胞，放入細胞培養箱。
(2)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，將凍存管中的細胞吸入准備好的 15ml 離心管中，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
(3)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，用解凍細胞第 2 種方法的，可以直接用凍存管離心，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
4、 第二天光鏡下觀察細胞。如果是帶著凍存液一起接種的細胞應進行換液。
細胞換液
細胞換液是指去除舊的培養基，換成新的完全培養基以繼續提供細胞充足的營養支持。當舊培養基 ph 值改變（含酚紅的培養基通常是變酸發黃）時，需要及時進行換液。
步驟：
1、 准備工作：
預熱完全培養基，酒精棉擦拭培養基瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開培養基瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。
如果是貼壁細胞，可以用全量換液法，直接吸去全部舊培養基，補充足量新鮮完全培養基。
如果是懸浮細胞，可以用半量換液法，即吸去一半舊培養基，補充新鮮完全培養基。（會損失一半細胞）。懸浮細胞如果不想損失細胞，那就需要將培養物轉移到離心管中，離心去除舊培養基，再用新培養基重懸細胞沉澱。
不光細胞維持培養時需要進行細胞換液，一些實驗操作也需要進行細胞換液。當換液操作是實驗需要時，可能在添加新的培養基前需要 PBS 清洗細胞以去除舊培養基的影響， 新添加的培養基也可根據實驗需求進行特殊配製，不一定是完全培養基。
細胞傳代 是指將細胞培養物分出來，重新接種到新的培養瓶/皿內，使細胞重新獲得足夠的生長空間的過程。
對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行傳代。
預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開試劑瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。
吸去舊的培養基，DPBS 洗細胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或無動物成分來源的 TryplLE），輕輕晃動培養瓶/皿，使消化液能均勻布滿所有細胞。
一些強貼壁的細胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗細胞，並在 37℃進行消化（加上消化液後放進 37℃細胞培養箱）。
用含EDTA 的胰蛋白酶來消化細胞的話，消化速度會更快。
強貼壁細胞或用特殊的無血清培養基培養的細胞使用 TrypLE 消化。
細胞消化的同時可以准備新的培養瓶/皿，往培養瓶/皿中添加適量新鮮培養基。
當鏡下觀察貼壁細胞直接的連接鬆散，細胞有所變形，但還沒有出現大片脫落時，吸去消化液，稍待一兩分鍾，讓殘留在細胞表面但是肉眼看不見的消化液進一步消化。
加入適量完全培養基，輕柔吹打細胞（用一層層「掃描」方式來吹打），不要忘了沿邊「清掃」。胰蛋白酶可以被完全培養基中含的血清終止。
EDTA 無法被終止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的細胞，可以在加完全培養基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。
TrypLE 無需終止，DPBS 稀釋即可，因此也可以在加完全培養基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。
最好控制不要消化過度，細胞成片脫落。當細胞消化過度時，只能通過離心去除消化液了。
吹打細胞時注意輕柔，控制泡沫，以免對細胞造成太多的細胞損傷。吸不凈，吹不凈， 槍尖始終保持在液體中可以有效控制泡沫產生。
在加入新培養基吹打細胞時即可規劃好，打算一盤細胞分成 N 盤，那就用 0.5N/1N ml 培養基進行細胞吹打。
將細胞吹打成細胞懸液後即可每個新瓶/皿接種 0.5 或 1ml，十字混勻後，送入細胞培養箱繼續培養。
通常細胞可以 1:2、1:3、1:4 傳。有些細胞不能傳太稀，容易狀態不好生長緩慢。
對懸浮細胞而言，因為不需要消化，傳代過程比較簡單，直接吸取一定量舊培養物接種到新培養瓶/皿即可。
細胞凍存 主要為了細胞保種，是指將細胞置於保護性液體中於低溫中長期儲存的技術。
對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行凍存。
預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑、DMSO 或無血清細胞凍存液，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。准備無菌細胞凍存管和 15ml 離心管，移入生物安全櫃/超凈工作台。
准備程序凍存盒（恢復至室溫）。如果使用添加異丙醇的程序凍存盒，注意異丙醇的量， 如不足，需添加，並且應該根據程序凍存盒說明書定期更換異丙醇。
按細胞傳代的做法進行細胞消化，吸去消化液後，1-2ml 完全培養基吹打成單細胞懸液。對懸浮細胞而言，無需消化，直接進入下一步離心收集細胞。
將單細胞懸液轉移到 15ml 離心管，500g×3min 離心，去除上清。
如使用無血清細胞凍存液，直接吸取無血清細胞凍存液重懸細胞，然後轉移到凍存管中擰緊蓋子。
如使用自製的細胞凍存液，需要先配製好細胞凍存液，方法如下：
優先使用培養該細胞的新鮮完全培養基配製，900ul 完全培養基+100ul DMSO=1ml 細胞凍存液（DMSO 含量 10%）。
DMSO 在加入培養基時會發熱，務必提前配製好凍存液，以免過熱損傷細胞。
對於嬌弱的細胞，可配成 2×細胞凍存液，先使用一定體積新鮮完全培養基重懸細胞，再逐滴滴加等體積 2×細胞凍存液（DMSO 終濃度還是 10%），吹打混勻，轉移到凍存管中。
自製細胞凍存液中的 DMSO 可適當降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。
在凍存一些比較嬌弱的原代細胞時，凍存液中的完全培養基可以用胎牛血清替代，即凍存液中只含胎牛血清和DMSO。
凍存細胞的量可以參考傳代時的比例，原則是讓復甦的細胞有充足的生長空間。推薦使用內旋式細胞凍存管，比較安全。
有些細胞凍存管的管蓋設計是特殊的，當第一次感覺擰緊時，此時並沒有真正擰緊，可以進一步擰，直到第二次感覺到擰緊。推薦使用這樣的凍存管，在溫度變化發生熱脹冷縮時不容易發生液體泄漏，減少污染的可能性。
使用無血清凍存液重懸的細胞，無需程序降溫，直接塞-80℃冰箱降溫，第二天轉移到液氮中。
使用自配細胞凍存液的細胞，需放進程序凍存盒後再置於-80℃冰箱中，第二天轉移到液氮中。
-80℃不適合長期保存凍存細胞（大概 1-2 年吧）。液氮中凍存的細胞十年之久都可以復甦成功。如需要更長期地保存細胞，應該定期復甦細胞後再次凍存。
程序凍存盒也可以自製，即使用大量脫脂棉花包裹凍存的細胞，或使用海綿包裹細胞。
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⑶ 為什麼 程序降溫盒中異丙醇用5次就要更換
一般凍存盒中加入甘油的居多吧。丙二醇，異丙醇加入後，一方面防止由於溶液效應而使細胞脫水及蛋白質變性；另一方面在稍低於溶液冰點時人工強行誘導結冰，以免出現溶液過冷現象，防止結冰時釋放潛熱引起溫度回升
⑷ 細胞培養之新手必看
細胞培養技術是細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究的基礎實驗技術之一。通過細胞培養可以直接觀察活細胞的形態結構和生命活動，聯合各種技術進行各種物理、化學生物的研究。
一、准備工作
細胞培養的准備工作是很重要，也很復雜的一項工作，應予以重視。
1.無菌室及無菌操作台
無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利於氣流之流通。實驗用品以70%
ethanol擦拭後才帶入無菌操作台內。實驗操作應在檯面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。實驗進行前，無菌室及無菌操作台(laminar
flow) 以紫外燈照射30-60 分鍾滅菌，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面，並開啟無菌操作台風扇運轉10 分鍾後，才開始實驗操作。
2.實驗材料的准備
2.1玻璃器皿的清洗、乾燥、消毒：
1）細胞培養的和主要是玻璃容器與pasteur pipet，其它均為塑料無菌製品。
2）實驗用的玻璃容器與pasteur pipet使用前都要進行清洗。新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈後才開始使用。
3）用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈後分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
4）實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鍾，置於oven中烘乾。實驗用玻璃pasteur pipet以乾熱滅菌170℃, 4 小時。
2.2培養容器：種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依實驗需要使用。
2.3 培養基的配製及分裝
1）細胞培養基通常須添加10%血清，液體培養基貯存於4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。液體培養基（加血清）存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
2）粉末培養基(以1升為例)之配製體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養基中會造成pH之誤差，或局部過鹼。因此粉末培養基及NaHCO3粉末應分別溶解後才混合，然後用CO2氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強鹼(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH易發生改變。高壓滅菌後添加血清。
3）為避免培養基污染，可以在培養基中添加雙抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若實驗或細胞不允許，可將培養基少量分裝。操作均在無菌條件下進行。
2.4 抗生素
1）ATCC細胞庫之細胞培養基不加抗生素
2）培養自其它實驗室引進之細胞株，製作token freeze前培養基須添加抗生素，待token freeze通過污染測試後，大量培養時則不加抗生素。
3）寄送活細胞時，須將培養液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
4）若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長。
5）去除細菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用後葯物毒性會增強。
6）抗生素使用種類與濃度：
2.5血清
1）血清必須貯存於–20～–70℃，若存放於4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝於無菌50ml離心管中，由於血清結凍時體積會增加約10%，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。
2）一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。
3）瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶後再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉澱的發生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沉澱。
3.培養箱及其他儀器的檢查與調試
1）CO2鋼瓶之CO2壓力。
2）CO2培養箱之CO2濃度(5%)、溫度(37度)、及更換水盤的無菌水(可添加消毒劑(Zephrin 1:750)每周更換。
3）無菌操作台內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA)。
4. 其他試劑的配製及滅菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可0.01M。高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鍾，室溫放冷，置於4度或常溫保存。
4.2 無菌水：雙蒸水高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鍾，室溫放冷，常溫保存。
二、細胞傳代培養
工作人員穿戴實驗衣及手套進入無菌室，小心取用實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開後，以手夾住瓶蓋並握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，並選擇適當等級之無菌操作台(至少Class
II)。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性葯品，例如DMSO及TPA等，並避免尖銳針頭之傷害等。
細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細胞種類而異。具體步驟：
粘附細胞：
1. 吸掉舊培養液。
2. 用PBS洗滌細胞一至二次。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數分鍾，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用後，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin作用，離心後再吸掉上清液)。
4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
懸浮細胞：
1.吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm5分鍾。
2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
三、細胞冷凍保存
步驟：
1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。
2. 配製冷凍保存溶液(使用前配製)：將DMSO加入新鮮培養基中，最後濃度為5-10％，混合均勻，置於室溫下待用。
3. 按細胞傳代培養操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液((約0.1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝於已標示完全之冷凍保存管中1ml/vial，並取少量細胞懸浮液作污染檢測。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置於4℃10分鍾→-20℃30分鍾→-80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存。
6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置於含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃，1～2天後再放入液氮槽中。
注意事項：
1. 欲冷凍保存的細胞應在生長良好且存活率高之狀態，約為80–90％緻密度。
2. 冷凍前檢測細胞仍保有其特有性質。
3.冷凍保護劑DMSO應為試劑級等級，無菌且無色，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌後避光保存。在開啟後一年內使用，因長期儲存後對細胞會有毒性。
4. 冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
四、細胞復甦
步驟：
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，並不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管並滴加10倍以上培養液，混勻；
3. 離心，1000rpm，5min；
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；
5. 次日更換一次培養液，繼續培養。
注意事項：
1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2 自液氮或乾冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。
3 將新鮮培養基置於37 ℃水槽中回溫，回溫後噴以70 % 酒精並擦拭之，移入無菌操作台內。
五、細胞計數與存活測試
1.存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。
2. 步驟：
2.1. 取50µl細胞懸浮液與50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻於1.5ml小離心管中。
2.2. 取少許混合液(約15µl)自細胞計數版上方凹槽加入，於100倍倒立顯微鏡下觀察，或於細胞計數儀中自動檢測活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosinbluish)。
2.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最後乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位於線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
4 大格*細胞總數x2x104/4=細胞數/ml