基因擴增怎麼設置程序

1. 簡述PCR技術操作步驟

PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

2. 用同一種引物，同一種酶，對葡萄的DNA和cDNA進行pcr擴增，設置的pcr程序

詳細內容可上試吧商城！！HotstartPCR：熱啟動PCR，是提高PCR特異性和可信度的最好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的PCR反應的發生而阻止引物與基因組DNA上潛在的高同源性區域結合引起的錯誤引發（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補區域鹼基配對而擴增產生的引物二聚體量大大降低。熱啟動PCR可通過三種方式實現：1)手動熱啟動：配置反應液時忽略一種關鍵成分（聚合酶、Mg離子或dNTP），當反應液升溫到80℃以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因為增加了一次開蓋操作，增加了污染的機會，同時由於管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴增結果產生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴增儀的暫停鍵，立即將反應管放在儀器上開始反應，當然這種方法的可信度也最低2)將聚合酶用石蠟珠包裹（或在反應液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固後，將聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應液的其它成分分開，直到反應液升溫融化石蠟後，酶才進入反應液中；3)使用熱啟動DNA聚合酶，這種酶通過化學修飾或與抗體結合，常溫下沒有活性，而只有當反應液加熱到變性溫度一段時間後，酶的活性才被釋放。使用熱啟動DNA聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點是用熱啟動DNA聚合酶的價格較高。TouchdownPCR：降落PCR，是另一種簡單的降低非特異性擴增的方法，可規避對PCR循環條件進行耗時的優化實驗。降落PCR過程中，首輪循環的退火溫度設置在比引物的解鏈溫度高出幾度，使每個後續循環的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到等於引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，後續的循環在此較低的退火溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低10-15℃。在最初幾個循環內，高溫使引物的非特異性結合難以發生，只有同引物互補程度最大的模板序列（很可能這一序列就是我們感興趣的序列）才能發生退火事件，因此保證靶序列得到優先擴增。後續循環降低退火溫度可保證擴增效率，盡管最終的退火溫度降低到足以使非特異性產物有效擴增的溫度，由於靶分子已經開始指數期擴增，因此抑制非特異性產物的進一步形成。NestedPCR：巢式PCR，通過使用兩套引物來進行兩次連續的反應，用來增加DNA擴增的特異性。在第一次反應中產生的產物可能包含非特異性擴增產物，然後使用兩個新的、結合位點位於原引物內部的引物進行第二次反應。第二套引物的使用可提高反應的特異性，增大單一產物產生的可能性。巢式PCR在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。Multiplex-PCR：多重PCR，指在一個PCR管中使用多對引物同時擴增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴增這些靶基造成對試劑和模板的浪費。使用多重PCR檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴增6個以上的靶點，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重PCR基礎上發展的MultiplexLigation-dependentProbeAmplification(MLPA，多重連接探針擴增技術)使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴增，避免了多重PCR耗時的優化步驟。LongPCR（LongdistancePCR，LongrangePCR）：長距離PCR，普通的Taq聚合酶一般只能擴增不超過3-5kb的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴增較長的DNA鏈（10-40kb以上）。長距離PCR時經常會在10-15個循環後，使每個循環的延伸時間都比上一循環的時間增加10秒左右，以補償聚合酶活性的損失。ClonyPCR：菌落PCR，通過PCR手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應混合液中，通過PCR預變性步驟的高溫使細菌的基因組釋放作為PCR反應的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位點外側的載體區，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴增反應的進行。RT-PCR（ReverseTranscriptionPCR）：逆轉錄PCR，是用來擴增、分離和鑒定細胞或組織的信使RNA（mRNA）的技術。反應由兩個階段組成：1.使用逆轉錄酶，通過逆轉錄反應「RT」合成與RNA互補的cDNA（complementaryDNA）2.使用PCR擴增特異性的cDNA。由於PCR的預變性步驟可以用來失活逆轉錄酶，所以兩個階段可在同一管內完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以單獨使用這種酶來完成兩步反應。RT-PCR可廣泛用於表達圖譜分析（用來確定基因的表達）；鑒定RNA轉錄子的序列，當相關的基因序列已知時，還可進一步知道基因組上外顯子和內含子的位置；檢測病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。RACE-PCR（rapidamplificationofcDNAends）：一種RT-PCR方法，當對DNA序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一個接頭引物來擴增cDNA的5'端（對應轉錄的起始位點）或3'端從而產生新的cDNA，重疊的RACE產物可結合起來產生全長的cDNA片段。DD-PCR(differentialdisplay)：差異顯示技術，用來鑒定不同組織中差異表達的基因。將不同組織的RT-PCR產物用短的、非特異性引物進行擴增，然後在凝膠上比對來源於不同組織的條帶，只在某種組織中才出現的條帶被認為是差異表達的。AsymmetricPCR：不對稱PCR，可選擇性的擴增出靶DNA的一條鏈，從而用於測序反應或制備單鏈雜交探針。反應中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，後續的擴增中另一引物延伸的產物量大大過量。這一技術的關鍵是使用的限制引物的量要合適，引物量過多，則產物主要是雙鏈DNA；引物量過少，在前幾輪循環就被耗盡，結果導致單鏈的產量減少。在不對稱PCR的基礎上發展出Linear-After-The-Exponential-PCR(LATE-PCR，線性指數PCR)，使數量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應效率。AssemblyPCR(也稱作PolymeraseCyclingAssembly或PCA)：通過使用多個具有短重疊區的長的寡核苷酸來合成長的DNA鏈的方法。通過寡核苷酸產生一條條正向或反向DNA鏈，而寡核苷酸的重疊區則確定鏈組裝的順序，因此可有選擇性的產生最終的長鏈DNA分子。Methylation-specificPCR(MSP)：甲基化特異性的PCR，用於研究基因組CpG島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物識別成胸腺嘧啶，然後分別用能區分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴增（一對可識別胞嘧啶引物擴增原來甲基化的模板，令一對可識別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴增非甲基化的模板）。結合定量PCR，可以對甲基化程度進行定量。Ligation-mediatedPCR：連接介導PCR，首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶DNA片段，然後選擇與接頭結合的PCR引物來擴增未知的靶片段。這一技術主要用在DNA測序、染色體步移技術（genomewalking）和DNA指紋圖譜等。AFLP（）：擴增片段長度多態性，通過擴增使不同生物基因組呈現不同長度的片段。AP-PCR(arbitraryprimed)/RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)：機擴增多態性DNA，使用隨機寡核苷酸片段來擴增序列未知的靶基因，形成基因組指紋圖譜，用來分析物種的相關性。VariableNumberofTandemRepeats(VNTR)PCR：可變數目串聯重復序列PCR，使引物定位在具有長度多態性的靶基因區，通過在凝膠電泳後對產物的大小進行分析來研究基因分型。Allele-specificPCR：等位基因特異性PCR，設計引物時選擇在基因組的多態性區域，使等位基因的突變定位在（或接近）引物的3'端，在嚴謹的反應條件下，存在錯配鹼基的引物不能起始復制，而只有完全匹配的引物才能起始復制，產生的產物因此顯示不同的基因型。InterSequence-SpecificPCR(ISSR-PCR)：一種DNA指紋圖譜技術，所選的引物定位在基因組的片段重復區（如Alu族），擴增後產生基於不同產物長度的唯一的指紋圖譜。InversePCR：反向PCR，允許擴增已知序列側翼的DNA區。首先將靶DNA用限制性內切酶進行多輪消化，然後連接被消化的片段構建環狀的分子，引物設計成可從序列已知的區域向外側延伸，結果擴增出環狀分子上剩餘的序列。QuantitativePCR(Q-PCR)：定量PCR，用來測定樣本中的靶DNA的量。最初的定量PCR主要是指CompetitivePCR（競爭定量PCR）。競爭定量PCR：在反應混合物中加入起始拷貝數已知的內部對照，對照具有同靶序列相同的引物結合位點，但產生的產物長度與靶序列產生的產物長度不同，在PCR過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應後通過比對對照和靶基因產生的產物量推斷初始靶基因的拷貝數，由於內部對照和靶基因在擴增中的效率不一定相同，所以定量結果會產生偏差。Real-TimePCR：實時PCR，由於通常的PCR在幾十個循環後都會進入平台期，產物的量與初始模板量不在成正比，因此只能用來定性。而實時PCR通過使用熒光染料，例如SYBRGreen或熒游標記探針，例如TaqMan可用來檢測隨著擴增的進行，產物量的變化而進行定量。

3. 基因擴增程序設定是什麼

基因擴增技術的具體方法和程序
試劑（1）引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。（3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合並，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。操作程序過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應成份分別加入一微量離心管中，然後置於一定的循環參數條件下進......閱讀全文

基因擴增技術的具體方法和程序
試劑（1）引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。（3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)

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PCR基因擴增儀的原理和程序
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什麼是基因擴增？基因擴增的應用和技術優勢
又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍,

4. PCR擴增的步驟

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
模板DNA的變性
模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
模板DNA與引 物的退火(復性)
模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
引物的延伸
DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。

5. 兩步法pcr程序設定

一步法,使用特殊引物,全程只設置一個溫度即可完成擴增.這種特殊引物有專利.
二步法即循環擴增中設置2個步驟,這個方法主要擴增短片段,一個是95度變性,另一個是退火與擴增的溫度,一般設置在55~60之間,當然也有例外.
三步法就是平常見到的方法,擴增循環有三步,變性,退火,延伸.

6. pcr擴增的原理和步驟

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環，使DNA得以成百萬倍的擴增。

(6)基因擴增怎麼設置程序擴展閱讀

PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。

這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。

它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

7. 基因擴增的基因擴增-PCR技術

多聚酶鏈式反應的原理類似於DNA的天然復制過程。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環後，DNA擴增2n倍。
1．變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2．退火：使溶液溫度降至50－60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合，即退火階段。
3．延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5』→3』方向復制出互補DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25-30個循環後DNA可擴增106-109倍。典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、兩個合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。 1.PCR熱循環儀 2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板
實驗試劑
1．10×緩沖液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI(pH8.3，室溫）、15mmol/LMgCl2
2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP
3.Tag酶5U/μL：
4.DNA模板1ng/μL：
5.引物1
6.引物2
7.引物溶液濃度2uM 1．在200ulEppendorf管內配製20ul反應體系
2．按下述程序進行擴增
94℃預變性3min；94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause 1．引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟體進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反復凍融多次；
2．PCR反應的各種成份不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；
3．根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；
4．注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。