程序性凍存盒使了多久後轉移液氮

⑴ 液氮凍存組織後多久才能轉移到

一般組織凍存都是先放到-70度，24小時後再放到液氮中，這樣對組織損傷較小，沒聽說先放到液氮然後再放到-70，還有要看你做什麼實驗，有必要都放進去嗎？你可以往液氮里放一部分，能保存半年，就是樓上說的放在自製的布袋裡就行，-70再放一部分，可以保存三個月，做實驗先用-70保存的，這樣不是很好嗎？本人拙見，不知對否。補充一點，少用凍存管，我們的經驗都是用布袋，凍存管容易炸。布袋很好做，找塊紗布縫一個也行。布袋用長線繩扎口，一端引到液氮罐外面。

⑵ 凍存盒放-80.後多久可以取出

冷凍4小時以上。
凍存管內的細胞已經處於凝固狀態，如果此時凍存管內還是液體，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現了問題。
如若遇到這種情況，不能因為時間到了，就把把液體狀態的凍存管放置到液氮中，可以適當延長在零下20℃環境下的冷凍時間30到60分鍾，直至凍存液凝固後再放到液氮中。

⑶ 2019-12-06

人正常肝細胞（ WRL68 ）的培養方法

細胞特性

2. 形態： 貼壁生長

3. 含量： >1x106

4 . 污染： 支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5. 規格： T25瓶或者1mL凍存管包裝

WRL68是目前唯一能提供的人正常幹細胞，之前很多人一直在問LO2,但是就目前情況來說，LO2在建系的時候就被海拉細胞污染了，所以基本無法提供，所以WRL68的重要性就凸顯出來了。

運輸和保存： 可選擇乾冰運輸及發送復甦存活細胞方式：（1）乾冰運輸，收到後立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復甦；（2）存活細胞，收到後應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。

細胞用途： 僅供科研使用。

細胞接收後的處理：

1.觀察好細胞狀態後，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h。

2.貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現象，如發現貼壁細胞有脫落或者脫落後抱團生長，可將T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到加有按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基的原培養瓶中（或新的培養瓶中）。

3. 懸浮細胞：T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養基和細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到新的培養瓶中（加入按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基）。

4.備註：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基來培養細胞。  收到細胞後第一次傳代建議1：2傳代 。

細胞培養步驟

一．培養基及培養凍存條件准備：

1.准備MEM（推薦iCell-0012）培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2.培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3.凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配

二.細胞處理

1.復甦細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液並檢查細胞密度。

2.細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對於貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

A 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

B 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於培養瓶中，置於37℃培養箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養瓶後加少量培養基終止消化。

C 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養液後吹勻

D .將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

注 ： 第一次傳代推薦傳代比例為 1:2 ，以後傳代比例可根據客戶需要自己決定。

3. 細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例

A.細胞凍存時，棄去培養基後，PBS清洗瓶底1-2次後加入1ml胰酶，細胞變圓脫落後，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

B.1000RPM離心5分鍾去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO後迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大於1X106個細胞凍存。

C.將凍存管置於程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以後轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項：

1. 收到細胞後，若發現乾冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全台內操作，並請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌後方能丟棄。

⑷ 細胞培養(換液/傳代/凍存/復甦)操作說明

所需試劑

細胞完全培養基：★ 推薦使用海星生物細胞配套專用培養基

1. 細胞處理後的第二天，在顯微鏡下觀察細胞狀態，如死細胞較多且細胞密度較低，需要進行換液操作。

  （1）懸浮細胞請在高倍鏡下觀察，一般而言，活細胞輪廓圓潤、界限清晰、透明度大、折光性強。如細胞活率較高，則繼續正常培養。

  （2）貼壁細胞如觀察到較多細胞漂浮，請在高倍鏡下觀察，判斷漂浮著的細胞是死細胞還是暫未貼壁的活細胞。如細胞活率較高，則繼續正常培養。

  （3）半貼壁細胞正常培養會有部分細胞漂浮，屬正常現象。請在高倍鏡下觀察，判斷漂浮著的細胞是否是死細胞。如細胞活率較高，則繼續正常培養。

2. 如需換液，參考以下步驟：

 （1）懸浮細胞：收集培養容器中的所有細胞懸液。250 g離心4 min後棄去上清。使用預熱的完全培養基重懸，將細胞懸液接種到合適的培養容器中。

 （2）貼壁細胞：直接棄去培養容器中的上清，添加預熱的完全培養基至原培養容器中。

 （3）半貼壁細胞：收集培養容器上清中的所有細胞，250 g離心4 min後棄去上清。使用預熱的完全培養基重懸，接種至原培養容器中。

3. 之後，每2~3天更換一次完全培養基，後續根據細胞生長密度和狀態傳代或凍存。

  注意: 若發現異常情況，應及時排查原因，並與我們聯系。

所需試劑

細胞完全培養基

貼壁和半貼壁細胞需要同時准備以下試劑：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（貨號: GUTP-R001，以下簡稱胰酶）

1×PBS（貨號: GUPB-R001，以下簡稱PBS）

1. 預熱完全培養基（貼壁和半貼壁細胞還需要預熱胰酶和PBS）。

2. 細胞收集。

 （1）懸浮細胞直接收集培養容器中的所有細胞懸液至離心管中。

 （2）貼壁/半貼壁細胞需要對細胞進行消化處理，步驟如下：

         ① 用PBS洗滌細胞2次。洗滌過程中注意動作輕柔，清洗全面。

         貼壁細胞直接棄去培養容器中的培養上清。用PBS洗滌細胞2次，洗滌後的PBS直接棄去，無需保留。

         半貼壁細胞需收集培養容器中的培養上清至離心管中。用PBS洗滌細胞2次，洗滌後的PBS需收集至離心管中。

        ② 加入胰酶，迅速鋪勻，確保其充分接觸細胞表面。

        ③ 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓後，輕拍培養容器外壁，使細胞脫離培養容器底面。立即加入胰酶雙倍體積的完全培養基，輕搖培養容器，使培養基和胰酶迅速混勻，終止消化。

        ④ 吸取細胞懸液，吹打培養容器底面數次，盡可能將細胞都吹打下來。將細胞懸液轉移至離心管中。

3. PBS洗滌培養容器1~2次，收集所有細胞懸液至離心管中。

4. 收集的所有細胞懸液250 g離心4 min。

5. 離心後去除上清。加入2 mL預熱的完全培養基，輕柔吹打細胞沉澱，充分吹散、混勻。

6. 將細胞按(2.5~4.0) ×10^4個活細胞/cm2接種至適宜的培養容器內。

注意:  如未計數，也可按照適宜比例進行傳代，但請根據細胞實際生長情況靈活調整傳代比例。

7. 搖勻細胞，將培養容器放入細胞培養箱中。

8. 後續根據細胞生長密度和狀態進行補液（懸浮細胞）/換液（貼壁/半貼壁細胞）、傳   代或凍存等操作。

所需試劑

凍存液

★ 推薦使用海星HyCyte™一步凍存液（即用型、無血清、無需程序降溫）

1. 待細胞生長至可傳代的密度，即可准備凍存。

2. 消化細胞，取少量細胞懸液計數。細胞懸液經250 g離心4 min。

3. 離心後去除上清，用適量4℃預冷的凍存液重懸細胞。將細胞按比例或數量分裝至凍 存管中。一般凍存密度為(1.0~2.0)×10^6個/mL。

 注意: 細胞長時間在非培養條件下放置會嚴重影響細胞的狀態。如離心後用凍存液重懸計數，請 將細胞放置於4℃冰箱內，以減弱細胞代謝，較好的保持細胞狀態。

4. 如使用海星一步凍存液，凍存管直接豎直放入-80℃冰箱即可完成「一步」凍存。如使用程序凍存液，需將凍存管放入提前預冷的程序降溫盒後放入-80℃冰箱。

5. 24小時後可將凍存管轉移到液氮進行長期保存。

    注意: 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議24 h後盡快轉移至液氮中。

所需試劑

細胞完全培養基

★ 推薦使用海星生物細胞配套專用培養基

1. 開啟37℃水浴鍋。預熱完全培養基，提前將細胞從液氮中取出，放於-80℃冰箱，讓凍存管中液氮揮發。

2. 潔凈工作台內准備15 mL離心管，加入5 mL預熱的完全培養基。

3. 從-80℃冰箱中取出細胞。快速將凍存管置於37℃水浴鍋內，快速晃動，使凍存液迅速融化。

    注意: ① 融化過程必須晃動凍存管，保證凍存液融化均勻。晃動時應避免水沒過管蓋增加污染風險。

             ② 管內凍存液融化至只剩一個約2mm直徑的冰晶時，可停止水浴。繼續晃動凍存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒凍存管表面。在潔凈工作台內小心開蓋，盡量避免氣泡溢出，輕柔吹打數次， 轉移至預先准備的離心管內。用少量完全培養基洗滌凍存管1~2次，一並收集至離心管內。

5. 250 g離心4 min。離心後去除上清。加入2 mL完全培養基，輕柔吹打細胞沉澱，充分 吹散、混勻。（如有台盼藍可取少量細胞懸液進行染色計數）

6. 將細胞平均接種到1個T25培養瓶或底面積相當的培養容器中，加入足量完全培養基， 搖勻細胞，將培養容器放入培養箱中培養。

7. 復甦次日，觀察細胞狀態並換液，具體操作見」細胞換液」。

    注意: 貼壁/半貼壁細胞接種24 h內不應擾動。部分細胞貼壁較慢，復甦後48 h不應擾動，具體注 意事項見相應細胞說明書。

細胞處理原則

·  嚴格的無菌環境。務必保證實驗室、超凈台/生物安全櫃和培養箱的清潔。

·  規范的操作方式。請按照操作說明描述的方式操作，注意操作細節。

·  需要合適的、質量可靠的實驗耗材和試劑。使用的試劑必須經驗證可靠，適宜細胞生長且批間差異小。

⑸ 干貨分享 | ATAC-seq 和 Hi-C 樣本制備

1. 凍存細胞樣本

（1）取出培養的懸浮細胞，顯微鏡下觀察細胞生長狀態是否良好，是否有細菌污染，然後用PBS洗滌並離心棄上清，細胞沉澱進行凍存操作（貼壁細胞需要消化為懸浮細胞）；

（2）用凍存液重懸細胞沉澱，移至凍存管（提前配置細胞凍存液，要避免新配置的凍存液過熱而損傷細胞）；

（3）凍存細胞解凍後，常規需要有5萬個狀態良好的細胞開展實驗，因此建議將50萬個細胞用於上述凍存操作；

（4）隨後，將凍存管置於程序降溫凍存盒，放在-80度進行梯度降溫並暫時保存（嚴格按照程序降溫操作，對細胞造成的損傷降到最低）；

（5）24 h後，將程序降溫盒中的細胞樣本轉移至液氮中保存。

2. 動物組織樣本

（1）取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪等雜質；

（2）將組織樣本轉移至新的離心管中，用預冷的PBS漂洗，直至將組織表面的殘留血液沖洗干凈；

（3）用無塵紙擦乾水分，如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊，約50 mg/份，之後置於凍存管內；

（4）將凍存管迅速置於液氮中冷凍30 mins，然後轉移至-80度中保存（要注意凍存管密封性和質量）。

3. 植物組織樣本

（1）從植株取下新鮮幼嫩組織，取材後用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干表面水分；

（2）如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊或薄片，然後放入合適體積的凍存管或錫箔紙中，每份>200 mg；

（3）將凍存管或錫箔紙置於液氮中冷凍30 mins，之後保存於-80度。

1. 細胞樣本

（1）確定細胞無污染，常規每個文庫建議培養1x10^6用於甲醛固定（低細胞量可評估）；（2）新鮮細胞計數後重懸於完全培養基中，加入甲醛（終濃度2%)，室溫固定10 mins；

（3）加入適量甘氨酸溶液，保證甲醛和甘氨酸充分混勻，培養基會由粉紅色變為亮黃色，室溫終止固定10 mins；

（4）離心棄上清，然後用PBS洗滌，再置於-80度保存。

2. 動物組織樣本

（1）組織離體後，用預冷的PBS將組織表面殘留洗凈；

（2）用無塵紙擦乾水分，在冰上將組織切成小塊，約200 mg/份（肝臟、腎臟、腦、肌肉），之後置於凍存管內（低組織量可評估）；

（3）將凍存管放入液氮中冷凍30 mins，然後轉至-80度保存。

3. 植物組織樣本

（1）將幼嫩組織小心清洗干凈，避免損傷；

（2）常規每個文庫建議准備1 g幼嫩組織（低組織量可評估）；

（3）用錫箔紙包裹組織，置於液氮中冷凍30 mins，然後轉至-80度保存。

⑹ 細胞培養|細胞凍存技術原理

1. 細胞凍存是將細胞儲存在低溫環境中，減少細胞代謝，實現長期儲存的一種技術。

2. 在大多數細胞系中，細胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的「培養漂移」，在凍存過程中，適當的操作和合適的凍存條件可以減少細胞特性的改變或丟失，起到細胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對於細胞的長久應用起著非常重要的作用。

1. 當溫度低至-70℃時，細胞內的酶活性全部停止，代謝活動停止，故實現長期保存的目的。

2. 隨著溫度降低，細胞內外的水分都會結晶，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞，從而引起細胞死亡，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，及其引發細胞損傷。在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。

3. 常見的冷凍保護劑是甘油或二甲基亞碸（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。

1. 細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。

2. 對特別敏感的細胞在凍存時需測試適用的凍存液。例如神經元細胞凍存時需選擇無血清凍存液，避免復甦後分化。

· 有限細胞系形態及代謝活動維持

· 珍貴細胞保種

· 細胞株標准品制備

· 臍帶血幹細胞、NK細胞凍存

1. 用來凍存的細胞一般選擇在細胞對數生長期，匯合度約 90% 的時候，這時細胞生長狀態好，細胞數量也多，並且在收獲細胞前 24 小時換一次培養液。

2. 對培養物進行微生物污染物檢測，特別是支原體，確保細胞沒有任何的污染。在細胞的收集過程中，實驗操作要盡可能的溫和，避免細胞受損。

1. 細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導致細胞損害。對大多數細胞來說，每分鍾降 1 至 3 ℃是合適的。

2. 梯度降溫法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷凍過夜，次日將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。

3. 細胞程序降溫盒，將准備好的細胞凍存管放進凍存盒，直接在-80℃過夜後就可以轉移至液氮罐中。

4. 在轉移存放位置的過程中一定要迅速，轉移時建議將凍存管放在乾冰中恆溫，盡量避免轉移過程因溫度變化對細胞活力的影響。

1. 細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

2. 細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。

3. 液氮罐中氣態層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態層，因為這樣可避免由於有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經常添加)。

HyCyte™凍存液是一種即用型、無血清、無需程序降溫的細胞「長期」凍存液，該產品配方使用已超過15年，原料均從日本進口，凍存品質與日本產品一致。

·  安全： 無血清，不含異種動物成份

·  廣譜： 適合多種細胞類型

·  高效： 復甦後細胞保持高活性及快速增殖  能力，不影響細胞功能

·  方便： 即用型，無需額外配製，無需程序降溫盒及稀釋

細胞膜保護劑—可在細胞膜外瞬間形成一層保護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。

滲透性保護劑—可迅速滲透至細胞內部，防止細胞內部產生大量冰晶，同時可保護細胞器，減少其在低溫下的損傷。

細胞沉降穩定劑—可平衡細胞沉降速度，防止細胞在凍存過程中聚集成團。

⑺ 細胞復甦、 換液、傳代、 凍存protocol

復甦
細胞復甦是指將凍存在液氮或-80℃的細胞解凍，恢復其生長的過程。操作原則：快！慢凍速融里的速融就是指細胞復甦過程。

步驟：
1、 准備工作：預熱完全培養基。多少℃培養的細胞就預熱到多少℃
在生物安全櫃/超凈工作台中，准備好細胞培養瓶/皿，並在其中添加足量預熱的完全培養基。
如果需要離心去除凍存細胞中的凍存液，此時也可以准備好 15ml 離心管，在管中添加1-2ml 預熱的完全培養基。

2、 解凍細胞。
做法有 2 種選擇：
(1)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速入 37℃水浴，輕搖解凍。凍存管口保持在水面上，以免水浴鍋中的水進入管中。
如果凍存細胞的地方離細胞房水浴鍋較遠，可以准備一個干凈的燒杯，燒杯中裝 37℃ 水，帶著燒杯去取細胞以實現迅速入水浴，或者路上利用體溫手搓凍存管到達水浴 時如未充分解凍再投入水浴繼續解凍。當凍存管中只剩一點小冰粒時，酒精棉擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。
(2)從-80℃或液氮中取出凍存的細胞，迅速酒精擦拭凍存管外表面，移入生物安全櫃/ 超凈工作台，向凍存管內加入適量預熱的完全培養基，並輕輕吹打以促使細胞融化。這個做法適合凍存管中有足夠空間以容納新加入的新鮮培養基。自己可以嘗試一下，哪種方法細胞融化速度快就用哪種方法。個人認為第 2 種快。

3、 接種細胞：
此時做法有 3 種選擇：
(1)如果是對凍存液成分耐受的細胞，可將凍存管中的細胞直接吸入准備好的培養瓶/皿， 輕輕十字搖晃混勻細胞，放入細胞培養箱。
(2)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，將凍存管中的細胞吸入准備好的 15ml 離心管中，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
(3)如果是對凍存液成分不耐受的細胞，用解凍細胞第 2 種方法的，可以直接用凍存管離心，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預熱的完全培養基重懸細胞沉澱並轉移到准備好的培養瓶/皿。
4、 第二天光鏡下觀察細胞。如果是帶著凍存液一起接種的細胞應進行換液。

細胞換液
細胞換液是指去除舊的培養基，換成新的完全培養基以繼續提供細胞充足的營養支持。當舊培養基 ph 值改變（含酚紅的培養基通常是變酸發黃）時，需要及時進行換液。
步驟：
1、 准備工作：
預熱完全培養基，酒精棉擦拭培養基瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。
細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開培養基瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。

如果是貼壁細胞，可以用全量換液法，直接吸去全部舊培養基，補充足量新鮮完全培養基。

如果是懸浮細胞，可以用半量換液法，即吸去一半舊培養基，補充新鮮完全培養基。（會損失一半細胞）。懸浮細胞如果不想損失細胞，那就需要將培養物轉移到離心管中，離心去除舊培養基，再用新培養基重懸細胞沉澱。

不光細胞維持培養時需要進行細胞換液，一些實驗操作也需要進行細胞換液。當換液操作是實驗需要時，可能在添加新的培養基前需要 PBS 清洗細胞以去除舊培養基的影響， 新添加的培養基也可根據實驗需求進行特殊配製，不一定是完全培養基。

細胞傳代 是指將細胞培養物分出來，重新接種到新的培養瓶/皿內，使細胞重新獲得足夠的生長空間的過程。

對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行傳代。

預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。

細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。可以稍等待，待生物安全櫃中的循環風將試劑瓶和培養瓶的外表面吹拂幾分鍾後，擰開試劑瓶蓋虛掩，擰開培養瓶瓶蓋虛掩，培養皿蓋不用擰。

吸去舊的培養基，DPBS 洗細胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或無動物成分來源的 TryplLE），輕輕晃動培養瓶/皿，使消化液能均勻布滿所有細胞。

一些強貼壁的細胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗細胞，並在 37℃進行消化（加上消化液後放進 37℃細胞培養箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶來消化細胞的話，消化速度會更快。

強貼壁細胞或用特殊的無血清培養基培養的細胞使用 TrypLE 消化。

細胞消化的同時可以准備新的培養瓶/皿，往培養瓶/皿中添加適量新鮮培養基。

當鏡下觀察貼壁細胞直接的連接鬆散，細胞有所變形，但還沒有出現大片脫落時，吸去消化液，稍待一兩分鍾，讓殘留在細胞表面但是肉眼看不見的消化液進一步消化。

加入適量完全培養基，輕柔吹打細胞（用一層層「掃描」方式來吹打），不要忘了沿邊「清掃」。胰蛋白酶可以被完全培養基中含的血清終止。

EDTA 無法被終止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的細胞，可以在加完全培養基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 無需終止，DPBS 稀釋即可，因此也可以在加完全培養基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化過度，細胞成片脫落。當細胞消化過度時，只能通過離心去除消化液了。

吹打細胞時注意輕柔，控制泡沫，以免對細胞造成太多的細胞損傷。吸不凈，吹不凈， 槍尖始終保持在液體中可以有效控制泡沫產生。

在加入新培養基吹打細胞時即可規劃好，打算一盤細胞分成 N 盤，那就用 0.5N/1N ml 培養基進行細胞吹打。

將細胞吹打成細胞懸液後即可每個新瓶/皿接種 0.5 或 1ml，十字混勻後，送入細胞培養箱繼續培養。

通常細胞可以 1:2、1:3、1:4 傳。有些細胞不能傳太稀，容易狀態不好生長緩慢。

對懸浮細胞而言，因為不需要消化，傳代過程比較簡單，直接吸取一定量舊培養物接種到新培養瓶/皿即可。

細胞凍存 主要為了細胞保種，是指將細胞置於保護性液體中於低溫中長期儲存的技術。

對單層生長的 貼壁細胞 而言，當細胞匯合度為 80%左右時，細胞狀態是最好的，此時適合進行凍存。

預熱完全培養基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細胞的試劑、DMSO 或無血清細胞凍存液，酒精棉擦拭瓶外表面後移入生物安全櫃/超凈工作台。

細胞培養箱中取出的細胞，酒精棉擦拭培養瓶/皿外表面，移入生物安全櫃/超凈工作台。准備無菌細胞凍存管和 15ml 離心管，移入生物安全櫃/超凈工作台。

准備程序凍存盒（恢復至室溫）。如果使用添加異丙醇的程序凍存盒，注意異丙醇的量， 如不足，需添加，並且應該根據程序凍存盒說明書定期更換異丙醇。

按細胞傳代的做法進行細胞消化，吸去消化液後，1-2ml 完全培養基吹打成單細胞懸液。對懸浮細胞而言，無需消化，直接進入下一步離心收集細胞。

將單細胞懸液轉移到 15ml 離心管，500g×3min 離心，去除上清。

如使用無血清細胞凍存液，直接吸取無血清細胞凍存液重懸細胞，然後轉移到凍存管中擰緊蓋子。

如使用自製的細胞凍存液，需要先配製好細胞凍存液，方法如下：

優先使用培養該細胞的新鮮完全培養基配製，900ul 完全培養基+100ul DMSO=1ml 細胞凍存液（DMSO 含量 10%）。

DMSO 在加入培養基時會發熱，務必提前配製好凍存液，以免過熱損傷細胞。

對於嬌弱的細胞，可配成 2×細胞凍存液，先使用一定體積新鮮完全培養基重懸細胞，再逐滴滴加等體積 2×細胞凍存液（DMSO 終濃度還是 10%），吹打混勻，轉移到凍存管中。

自製細胞凍存液中的 DMSO 可適當降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。

在凍存一些比較嬌弱的原代細胞時，凍存液中的完全培養基可以用胎牛血清替代，即凍存液中只含胎牛血清和DMSO。

凍存細胞的量可以參考傳代時的比例，原則是讓復甦的細胞有充足的生長空間。推薦使用內旋式細胞凍存管，比較安全。

有些細胞凍存管的管蓋設計是特殊的，當第一次感覺擰緊時，此時並沒有真正擰緊，可以進一步擰，直到第二次感覺到擰緊。推薦使用這樣的凍存管，在溫度變化發生熱脹冷縮時不容易發生液體泄漏，減少污染的可能性。

使用無血清凍存液重懸的細胞，無需程序降溫，直接塞-80℃冰箱降溫，第二天轉移到液氮中。

使用自配細胞凍存液的細胞，需放進程序凍存盒後再置於-80℃冰箱中，第二天轉移到液氮中。

-80℃不適合長期保存凍存細胞（大概 1-2 年吧）。液氮中凍存的細胞十年之久都可以復甦成功。如需要更長期地保存細胞，應該定期復甦細胞後再次凍存。

程序凍存盒也可以自製，即使用大量脫脂棉花包裹凍存的細胞，或使用海綿包裹細胞。

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⑻ ES培養基成分

不同的ES配方多少有些差異.基礎培養基一般用DMEM或DF12.（以下為DMEM培養基為例）

1、提前一天將分裝好的FBS從—20℃冰箱取出，放於4℃冰箱化凍;

2、在細胞間中將FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸鈉、抗生素等)，按照比例加入dmem培養基中，作好標簽;放入4℃冰箱保存。

ES細胞培養方法：

1. 化凍

   將血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)從-20℃冰箱取出，放於4℃冰箱化凍過夜;也可室溫(或浸於自來水中)化凍，化凍後若不馬上滅活，可以放入4℃冰箱暫時保存;

2. 滅活
   (1) 放入室溫的水浴鍋內開始加熱(同時放入一個內裝200 ml自來水的血清瓶，插入一根溫度計，溫度監控以此為准);
   (2) 當溫度計顯示56℃時，控制在此溫度30分鍾±3分鍾;若不小心使溫度上升超過56℃，則：若仍未超過60℃，且時間很短(比如：不超過5分鍾)，則仍可使用;若超過60℃，或者時間較長，則棄去不用，或者嘗試用於ME

   胞的培養;
   (2) 取出，自然冷卻至室溫(約需1-3小時)，可分裝或-20℃繼續凍存;

3. 分裝
   (1)轉入細胞間，用移液器將血清分裝，注意預先要將血清輕輕搖動數周、混勻;吹出血清時要注意：不要吹出氣泡(血清很粘稠，很容易產生氣泡;如果已產生氣泡，則在酒精燈火焰上過一下);標好批號和日期;
   (2)放入-20℃冰箱凍存(分裝一次大約可以使用1—2個月)。

原代胚胎成纖維細胞(ME)的制備

1.取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死;

2.將鼠腹面向上放置，70% 酒精潤濕、消毒腹部(防止腹毛飛揚，污染內臟及子宮)，剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉入無菌10cm平皿中;

3. 把平皿轉入超凈台;

4. 用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，並與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內臟(主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等);

5. 將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次;

6. 棄去PBS，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本無色(1-4次);

7. 加入適量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520，下同)，體積約等於組織塊體積;

8. 用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1-10分鍾(或消化至溶液渾濁變粘)，加入與消化液等體積培養基，輕輕吹打混勻(5-10次)，靜置;

9. 沉降後將上部溶液輕輕吸出，轉入離心管中。

10. 將細胞懸液管離心(1000轉5分鍾);

11. 棄去上清，向沉澱中加入適量培養基，輕輕吹打重懸，將其分種至10 cm細胞培養皿，補加適量培養基，作標簽(ME-0;注意：若凍存，則可以使用復甦後的0代ME製作Feeder;若直接使用則最好不用0代ME細胞做Feeder，要傳到一代以後再用來製作Feeder比較好)，轉入培養箱培養;

12. 視細胞生長情況換液(一般3天換液一次)，若細胞已長滿，則凍存，或者1：3-5傳代(視細胞疏密而定)，放入培養箱繼續培養(此後不用再換液);1-5代的ME細胞均可用來製作Feeder。

飼養層細胞(Feeder)的制備

註：含10 ug/ml絲裂黴素C的DMEM血清培養基(FBS佔10%)(實驗室所用MMC為10 mg/mL，Calbiochem)

1. 棄去細胞培養皿中的培養液，加入適量含10ug/ml絲裂黴素C的培養基(DMEM+10% FBS);

2. 放入培養箱培養3小時(2-4小時);

3. 用0.1% 明膠處理培養皿(將明膠加入，搖動使明膠覆蓋全部皿底，然後吸出明膠棄去即可)，室溫放置2小時以上，至皿底明膠乾燥為止;

4. 棄去含有絲裂黴素C的培養基，加入2-3 mL PBS，輕輕搖動，棄去PBS，如此洗3-5次(必須洗3次以上，以便徹底洗去殘存的絲裂黴素，絲裂黴素是有絲分裂抑制劑，因而對ES細胞有毒性);

5. 加入適量胰酶消化30秒，吸去消化液，靜置至細胞層出現裂縫或明顯滑壁為止，加入培養基，吹打，種至明膠處理過的培養皿中即可(如細胞過稀，可再補加絲裂黴素處理過的細胞)，半小時後即可使用(如果急用，則可以用ES細胞培養基終止消化，然後與ES細胞一起轉入明膠處理過的新板上)，可使用6-10天，用前更換培養液(如未用明膠處理培養皿，則需在培養箱中放置2小時以上方可使用;最好是前一天下午製作Feeder，第二天上午使用，這時的Feeder狀態最好，最適於ES細胞貼壁生長，而且萬一製作的Feeder在第二天早上發現出了問題，還可以趕緊補做)。

ES細胞的復甦

1. 提前制備好相應數量的Feeder;

2. 准備37-39℃的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管(凍存細胞)，迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動直至凍存液全部融化;

3. 轉入無菌間，1000轉/分鍾離心5-10分鍾;
   
   

4. 棄上清，加入1 ml ES培養液輕輕吹打重懸，轉入鋪有飼養層細胞的培養皿中(凍存前細胞來自多大的培養皿，復甦時就用相應大小的培養皿)，補加適量培養液;

5. 轉入培養箱培養，次日換液;此後每24小時換一次液，每48小時傳一次代(視生長情況)。

ES細胞的換液

1. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出，放於室溫(或者放於37℃溫箱內)；

2.細胞培養皿從培養箱內取出，相差顯微鏡下作常規觀察(判斷生長情況，並確證未發生污染)後轉入無菌操作台內;

3. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去，換新鮮培養基(6 cm培養皿約5 mL，3.5 cm培養皿約3 mL培養基;若死細胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養基);

4. 放回培養箱繼續培養。

ES細胞的傳代

1. 前一天下午做好所需數量的Feeder細胞板;

2. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出，放於室溫(或者放於37℃溫箱內);

3. 將ES細胞培養皿、Feeder細胞培養皿從培養箱內取出(相差顯微鏡下作常規觀察，Feeder細胞應生長良好，細胞覆蓋95%左右，至少90%以上的培養皿面積);ES細胞應生長良好，接近長滿培養皿，細胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑，細胞生長緻密、核大、胞質少;

4. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去;再作用1—5分鍾，不時觀察，待細胞層(皿底一層白色臟東西樣膜)出現裂縫並明顯開始下滑時，補加培養基，適度吹打(視消化程度及管口粗細而定，至看不到明顯的大的細胞團塊為止);平均分到Feeder培養皿中(滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來)，滴加補加培養基至5 ml左右(滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來;若為3.5cm培養皿，則補加至3ml左右)，作好標簽;

5. 前後左右水平晃動培養皿，使ES細胞均勻分布於培養皿中，放入培養箱繼續培養。

   
   

ES細胞的凍存

1. 常規方法將細胞消化成單細胞懸液;

2. 轉入試管，1000轉/分鍾離心5分鍾;

3. 配適量凍存液(為含10% 二甲亞碸(DMSO)，10% FBS的DMEM培養液);

4. 棄上清，每管加入1ml凍存液，吹打成細胞懸液(只要使ES細胞分散成3—5個細胞的小團塊即可)，轉入凍存管，作好標簽;

5. 放入程序凍存盒內24小時後轉入液氮罐中凍存。