1. 程序降溫盒中途若是打開會怎麼樣
溫度升高。破壞盒中細胞。程序降溫盒使用的降溫法，為一種特製冷凍容器，使細胞以每分鍾約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然後移至液氮中保存。再冷凍的過程中不能開盒，開盒會使溫度升高，破壞盒中培養的細胞。導致實驗結果有誤差甚至失敗。
2. 細胞放在凍存管里然後放程序降溫盒裡，但是沒有立刻放-80……
沒事啊，正常步驟就應該4攝氏度2h，-20攝氏度2h，-80攝氏度2h，然後放液氮罐。
3. 聚乙烯程序降溫盒原理
聚乙烯程序降溫盒原理，見下面:
1.聚乙烯程序降溫盒原理是將冷凍過程中溫度變化通過智能溫控儀表的RS485通訊協議介面傳輸給計算機的上位機軟體。
2.上位機軟體按照用戶的編程，計算出當前的目標溫度與實測溫度的偏差值，用比例、微分、積分演算法算出控制量。
4. 細胞培養之新手必看
細胞培養技術是細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究的基礎實驗技術之一。通過細胞培養可以直接觀察活細胞的形態結構和生命活動，聯合各種技術進行各種物理、化學生物的研究。
一、准備工作
細胞培養的准備工作是很重要，也很復雜的一項工作，應予以重視。
1.無菌室及無菌操作台
無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利於氣流之流通。實驗用品以70%
ethanol擦拭後才帶入無菌操作台內。實驗操作應在檯面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。實驗進行前，無菌室及無菌操作台(laminar
flow) 以紫外燈照射30-60 分鍾滅菌，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面，並開啟無菌操作台風扇運轉10 分鍾後，才開始實驗操作。
2.實驗材料的准備
2.1玻璃器皿的清洗、乾燥、消毒：
1）細胞培養的和主要是玻璃容器與pasteur pipet，其它均為塑料無菌製品。
2）實驗用的玻璃容器與pasteur pipet使用前都要進行清洗。新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈後才開始使用。
3）用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈後分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
4）實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鍾，置於oven中烘乾。實驗用玻璃pasteur pipet以乾熱滅菌170℃, 4 小時。
2.2培養容器：種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依實驗需要使用。
2.3 培養基的配製及分裝
1）細胞培養基通常須添加10%血清，液體培養基貯存於4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。液體培養基（加血清）存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
2）粉末培養基(以1升為例)之配製體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養基中會造成pH之誤差，或局部過鹼。因此粉末培養基及NaHCO3粉末應分別溶解後才混合，然後用CO2氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強鹼(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH易發生改變。高壓滅菌後添加血清。
3）為避免培養基污染，可以在培養基中添加雙抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若實驗或細胞不允許，可將培養基少量分裝。操作均在無菌條件下進行。
2.4 抗生素
1）ATCC細胞庫之細胞培養基不加抗生素
2）培養自其它實驗室引進之細胞株，製作token freeze前培養基須添加抗生素，待token freeze通過污染測試後，大量培養時則不加抗生素。
3）寄送活細胞時，須將培養液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
4）若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長。
5）去除細菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用後葯物毒性會增強。
6）抗生素使用種類與濃度：
2.5血清
1）血清必須貯存於–20～–70℃，若存放於4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝於無菌50ml離心管中，由於血清結凍時體積會增加約10%，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。
2）一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。
3）瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶後再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉澱的發生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沉澱。
3.培養箱及其他儀器的檢查與調試
1）CO2鋼瓶之CO2壓力。
2）CO2培養箱之CO2濃度(5%)、溫度(37度)、及更換水盤的無菌水(可添加消毒劑(Zephrin 1:750)每周更換。
3）無菌操作台內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA)。
4. 其他試劑的配製及滅菌
4.1 PBS(PH7.4，1L)：稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可0.01M。高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鍾，室溫放冷，置於4度或常溫保存。
4.2 無菌水：雙蒸水高壓蒸汽滅菌121℃,15 lb,20分鍾，室溫放冷，常溫保存。
二、細胞傳代培養
工作人員穿戴實驗衣及手套進入無菌室，小心取用實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開後，以手夾住瓶蓋並握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，並選擇適當等級之無菌操作台(至少Class
II)。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性葯品，例如DMSO及TPA等，並避免尖銳針頭之傷害等。
細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細胞種類而異。具體步驟：
粘附細胞：
1. 吸掉舊培養液。
2. 用PBS洗滌細胞一至二次。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數分鍾，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用後，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin作用，離心後再吸掉上清液)。
4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
懸浮細胞：
1.吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm5分鍾。
2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
三、細胞冷凍保存
步驟：
1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。
2. 配製冷凍保存溶液(使用前配製)：將DMSO加入新鮮培養基中，最後濃度為5-10％，混合均勻，置於室溫下待用。
3. 按細胞傳代培養操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液((約0.1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝於已標示完全之冷凍保存管中1ml/vial，並取少量細胞懸浮液作污染檢測。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置於4℃10分鍾→-20℃30分鍾→-80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存。
6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置於含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃，1～2天後再放入液氮槽中。
注意事項：
1. 欲冷凍保存的細胞應在生長良好且存活率高之狀態，約為80–90％緻密度。
2. 冷凍前檢測細胞仍保有其特有性質。
3.冷凍保護劑DMSO應為試劑級等級，無菌且無色，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌後避光保存。在開啟後一年內使用，因長期儲存後對細胞會有毒性。
4. 冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
四、細胞復甦
步驟：
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，並不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管並滴加10倍以上培養液，混勻；
3. 離心，1000rpm，5min；
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；
5. 次日更換一次培養液，繼續培養。
注意事項：
1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2 自液氮或乾冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。
3 將新鮮培養基置於37 ℃水槽中回溫，回溫後噴以70 % 酒精並擦拭之，移入無菌操作台內。
五、細胞計數與存活測試
1.存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。
2. 步驟：
2.1. 取50µl細胞懸浮液與50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻於1.5ml小離心管中。
2.2. 取少許混合液(約15µl)自細胞計數版上方凹槽加入，於100倍倒立顯微鏡下觀察，或於細胞計數儀中自動檢測活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosinbluish)。
2.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最後乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位於線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
4 大格*細胞總數x2x104/4=細胞數/ml
5. 2019-12-06
人正常肝細胞（ WRL68 ）的培養方法
細胞特性
2. 形態： 貼壁生長
3. 含量： >1x106
4 . 污染： 支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性
5. 規格： T25瓶或者1mL凍存管包裝
WRL68是目前唯一能提供的人正常幹細胞，之前很多人一直在問LO2,但是就目前情況來說，LO2在建系的時候就被海拉細胞污染了，所以基本無法提供，所以WRL68的重要性就凸顯出來了。
運輸和保存： 可選擇乾冰運輸及發送復甦存活細胞方式：（1）乾冰運輸，收到後立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復甦；（2）存活細胞，收到後應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。
細胞用途： 僅供科研使用。
細胞接收後的處理：
1.觀察好細胞狀態後，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h。
2.貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現象，如發現貼壁細胞有脫落或者脫落後抱團生長，可將T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到加有按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基的原培養瓶中（或新的培養瓶中）。
3. 懸浮細胞：T25瓶置於37℃培養箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養基和細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到新的培養瓶中（加入按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基）。
4.備註：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配製的完全培養基來培養細胞。 收到細胞後第一次傳代建議1：2傳代 。
細胞培養步驟
一．培養基及培養凍存條件准備：
1.准備MEM（推薦iCell-0012）培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2.培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。
3.凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配
二.細胞處理
1.復甦細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液並檢查細胞密度。
2.細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
對於貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
A 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
B 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於培養瓶中，置於37℃培養箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養瓶後加少量培養基終止消化。
C 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養液後吹勻
D .將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
注 ： 第一次傳代推薦傳代比例為 1:2 ，以後傳代比例可根據客戶需要自己決定。
3. 細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例
A.細胞凍存時，棄去培養基後，PBS清洗瓶底1-2次後加入1ml胰酶，細胞變圓脫落後，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。
B.1000RPM離心5分鍾去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO後迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大於1X106個細胞凍存。
C.將凍存管置於程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以後轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項：
1. 收到細胞後，若發現乾冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。
2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全台內操作，並請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌後方能丟棄。
6. 程序降溫盒放室溫多久可以用
將程序降溫盒放入-80℃冰箱,冷凍4小時以上以達到凍存效果即可使用。
7. 細胞凍存盒沒有海綿可以用嗎
細胞凍存盒沒有海綿可以用。凍存盒也可以自製，即使用大量脫脂棉花包裹凍存的細胞，或使用海綿包裹細胞。更多使用程序降溫盒，將細胞凍存管放於盒內，直接置於超低溫冰箱，程序降溫盒可控制每分鍾下降1℃。目前也有商業化的快速凍存液。
8. 干貨分享 | ATAC-seq 和 Hi-C 樣本制備
1. 凍存細胞樣本
（1）取出培養的懸浮細胞，顯微鏡下觀察細胞生長狀態是否良好，是否有細菌污染，然後用PBS洗滌並離心棄上清，細胞沉澱進行凍存操作（貼壁細胞需要消化為懸浮細胞）；
（2）用凍存液重懸細胞沉澱，移至凍存管（提前配置細胞凍存液，要避免新配置的凍存液過熱而損傷細胞）；
（3）凍存細胞解凍後，常規需要有5萬個狀態良好的細胞開展實驗，因此建議將50萬個細胞用於上述凍存操作；
（4）隨後，將凍存管置於程序降溫凍存盒，放在-80度進行梯度降溫並暫時保存（嚴格按照程序降溫操作，對細胞造成的損傷降到最低）；
（5）24 h後，將程序降溫盒中的細胞樣本轉移至液氮中保存。
2. 動物組織樣本
（1）取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪等雜質；
（2）將組織樣本轉移至新的離心管中，用預冷的PBS漂洗，直至將組織表面的殘留血液沖洗干凈；
（3）用無塵紙擦乾水分，如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊，約50 mg/份，之後置於凍存管內；
（4）將凍存管迅速置於液氮中冷凍30 mins，然後轉移至-80度中保存（要注意凍存管密封性和質量）。
3. 植物組織樣本
（1）從植株取下新鮮幼嫩組織，取材後用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干表面水分；
（2）如果組織體積較大，應在冰上將組織切成小塊或薄片，然後放入合適體積的凍存管或錫箔紙中，每份>200 mg；
（3）將凍存管或錫箔紙置於液氮中冷凍30 mins，之後保存於-80度。
1. 細胞樣本
（1）確定細胞無污染，常規每個文庫建議培養1x10^6用於甲醛固定（低細胞量可評估）；（2）新鮮細胞計數後重懸於完全培養基中，加入甲醛（終濃度2%)，室溫固定10 mins；
（3）加入適量甘氨酸溶液，保證甲醛和甘氨酸充分混勻，培養基會由粉紅色變為亮黃色，室溫終止固定10 mins；
（4）離心棄上清，然後用PBS洗滌，再置於-80度保存。
2. 動物組織樣本
（1）組織離體後，用預冷的PBS將組織表面殘留洗凈；
（2）用無塵紙擦乾水分，在冰上將組織切成小塊，約200 mg/份（肝臟、腎臟、腦、肌肉），之後置於凍存管內（低組織量可評估）；
（3）將凍存管放入液氮中冷凍30 mins，然後轉至-80度保存。
3. 植物組織樣本
（1）將幼嫩組織小心清洗干凈，避免損傷；
（2）常規每個文庫建議准備1 g幼嫩組織（低組織量可評估）；
（3）用錫箔紙包裹組織，置於液氮中冷凍30 mins，然後轉至-80度保存。
9. 細胞培養|細胞凍存技術原理
1. 細胞凍存是將細胞儲存在低溫環境中，減少細胞代謝，實現長期儲存的一種技術。
2. 在大多數細胞系中，細胞會隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的「培養漂移」，在凍存過程中，適當的操作和合適的凍存條件可以減少細胞特性的改變或丟失，起到細胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對於細胞的長久應用起著非常重要的作用。
1. 當溫度低至-70℃時，細胞內的酶活性全部停止，代謝活動停止，故實現長期保存的目的。
2. 隨著溫度降低，細胞內外的水分都會結晶，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞，從而引起細胞死亡，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，及其引發細胞損傷。在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。
3. 常見的冷凍保護劑是甘油或二甲基亞碸（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。
1. 細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。
2. 對特別敏感的細胞在凍存時需測試適用的凍存液。例如神經元細胞凍存時需選擇無血清凍存液，避免復甦後分化。
· 有限細胞系形態及代謝活動維持
· 珍貴細胞保種
· 細胞株標准品制備
· 臍帶血幹細胞、NK細胞凍存
1. 用來凍存的細胞一般選擇在細胞對數生長期，匯合度約 90% 的時候，這時細胞生長狀態好，細胞數量也多，並且在收獲細胞前 24 小時換一次培養液。
2. 對培養物進行微生物污染物檢測，特別是支原體，確保細胞沒有任何的污染。在細胞的收集過程中，實驗操作要盡可能的溫和，避免細胞受損。
1. 細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導致細胞損害。對大多數細胞來說，每分鍾降 1 至 3 ℃是合適的。
2. 梯度降溫法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷凍過夜，次日將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。
3. 細胞程序降溫盒，將准備好的細胞凍存管放進凍存盒，直接在-80℃過夜後就可以轉移至液氮罐中。
4. 在轉移存放位置的過程中一定要迅速，轉移時建議將凍存管放在乾冰中恆溫，盡量避免轉移過程因溫度變化對細胞活力的影響。
1. 細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。
2. 細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。
3. 液氮罐中氣態層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態層，因為這樣可避免由於有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經常添加)。
HyCyte™凍存液是一種即用型、無血清、無需程序降溫的細胞「長期」凍存液，該產品配方使用已超過15年，原料均從日本進口，凍存品質與日本產品一致。
· 安全： 無血清，不含異種動物成份
· 廣譜： 適合多種細胞類型
· 高效： 復甦後細胞保持高活性及快速增殖 能力，不影響細胞功能
· 方便： 即用型，無需額外配製，無需程序降溫盒及稀釋
細胞膜保護劑—可在細胞膜外瞬間形成一層保護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。
滲透性保護劑—可迅速滲透至細胞內部，防止細胞內部產生大量冰晶，同時可保護細胞器，減少其在低溫下的損傷。
細胞沉降穩定劑—可平衡細胞沉降速度，防止細胞在凍存過程中聚集成團。
10. 程序降溫盒能放-20嗎
不能。
程序降溫盒：液氮或低溫儲存（只要低於-135℃即可）。程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特製冷凍容器，使細胞以每分鍾約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然後移至液氮中保存。