A. RNA-Seq數據分析——原始數據質量控制（QC）
RNA-Seq原始數據質量控制(QC)是非常重要的一個環節，由於各種原因，例如測序平台、實驗操作等，原始測序數據可能存在不少問題，如低質量讀段、接頭序列、污染序列等。為了確保後續分析的准確性，需要先進行質量控制。
一、常用工具：
常用的質量控制工具有FastQC、MultiQC等，這些工具能提供測序數據的基本統計信息和質量報告。
二、QC主要步驟：
1.基本統計：
統計讀段數量、平均長度等。
2.質量評分：
評估測序讀段的質量分布，通常使用Phred質量分數。
3.接頭和污染序列檢測：
查找和去除可能的接頭序列和其他非目標序列。
4.GC含量分布：
檢查GC含量的分布，以判斷潛在的偏見或污染。
5.重復序列分析：
評估重復讀段的比例，高重復率可能意味著PCR偏見。
6.去除低質量讀段：
基於設定的質量閾值去除低質量的讀段。
7.後續步驟：
完成質量控制後，通常會進行比對、定量和差異表達分析等後續步驟。
B. 一文簡介RNAseq生信分析流程
RNAseq簡介
轉錄組測序分析（RNA-seq）通過提取並反轉錄特定mRNA，使用高通量測序統計相關小片段，以計算不同mRNA的表達量。此方法能精確識別可變剪切位點及編碼序列單核苷酸多態性，為研究某一物種特定組織或器官的轉錄本序列提供了全面信息。RNA-seq在基礎研究、臨床診斷和葯物研發中廣泛應用。
RNAseq分析流程
RNA-seq流程一般包括實驗設計、質量控制、比對、基因和轉錄定量、表達可視化、差異基因篩選、選擇性剪接、功能分析和基因融合檢測等模塊。分析步驟多樣，需要根據具體實驗目的選擇合適的方法。實驗設計時需考慮目標RNA提取策略、文庫類型、測序深度和實驗重復次數。質量控制環節檢查測序數據質量，包括測序深度、基因覆蓋度均一性和測序飽和度。比對過程需使用適合的軟體，根據研究目標選擇比對到參考基因組或轉錄組。新轉錄本發現、基因和轉錄定量、差異基因表達分析、可變剪接分析和基因融合檢測等步驟同樣依賴於多種軟體工具。分析流程結束生成統計報告。
六點了官網的RNAseq流程
六點了官網提供了一套通用RNAseq分析流程，涵蓋數據過濾、比對、定量、差異分析、功能分析和可變剪接檢測等環節。流程自動化生成統計報告，簡化了分析過程。歡迎有需求的用戶咨詢。
RNAseq分析流程詳解
實驗設計：明確目標、選擇提取策略和文庫類型、確定測序深度和重復次數。
質量控制：檢查原始測序數據質量，包括序列質量、接頭存在、過度表達的kmer和重復序列分析。
比對：選擇合適軟體，直接比對到參考基因組或轉錄組上。
新轉錄本發現：使用特定工具識別。
基因和轉錄定量：整合比對結果，統計讀數數量，轉化為RPKM/FPKM/TPM。
差異基因表達分析：尋找組間顯著表達變化的基因。
可變剪接分析：檢測轉錄本結構的變異。
基因融合檢測：識別基因序列融合。
六點了官網提供的流程：一站式分析服務，自動化報告生成。
C. RNA-seq原理詳解
RNA-seq原理詳解
1. 測序與定量: 先從測序得到的fastq文件出發，通過與參考序列進行比對與表達定量，生成原始的定量結果。結果顯示在基因名與不同細胞系/處理名稱的矩陣中，其中數字代表測序結果的定量值。
2. 數據標准化: DESeq2將原始reads進行建模，通過標准化因子（scale factor/size factor）來調整庫深度差異。接下來，DESeq2估計基因的離散度，並縮小估計值，以此對reads count進行更精確的建模。標准化步驟包括：log轉換、平均值計算、移除異常值、log轉換與平均值差值計算、中位數計算與指數計算，最終得出樣本的校正因子。
3. 差異分析: 計算log2foldchange與p值等，評估基因表達差異。results函數提取分析結果，包含基因在不同樣本中的平均值、log2fold變化、標准誤差、檢驗統計量、p值與調整p值。若某些基因在所有樣本中表達量接近0，則無法計算lfcSE和pvalue，需將其移除，剩下17983個基因的差異表達結果。
4. 結果可視化: 基於原始測序文件fastq的表達定量，可繪制PCA圖展示主成分分析，通過RNA-seq差異分析，繪制熱圖表示相對表達量（CPM），火山圖則用於展示pvalue與foldchange。
實踐指導與參考資源: 具體操作需親自動手實踐，過程中可能遇到bug。建議閱讀相關文獻與教程，包括但不限於jianshu.com、cnblogs.com、Question：如何計算基因表達的「fold changes」、Exact Negative Binomial Test with edgeR、Differential gene expression analysis、hbctraining.github.io/與Beginner's guide to using the DESeq2 package等。