Ⅰ 流式細胞術，你這磨人的小妖精
流式細胞術（Flow Cytometry ，FCM）是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒逐個進行快速定量分析和分選的技術。
一、小妖精的成仙之路
二、樣本類型
流式細胞儀可檢測多種樣本：外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液、實體組織、培養細胞、微生物。
三、工作原理
流式細胞儀主要由3部分組成：液流系統、光學系統、電子系統。進行熒光染色後的待測細胞會在一定氣體壓力下被壓入流動室，在鞘液的包裹下待測細胞呈單行排列，依次通過檢測區域，被熒光染色的細胞在激光束的照射下會產生散射光和激發熒光。這兩種信號會同時被光電倍增管( PMT) 接收。接收後可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。
四、流式細胞術的應用
五、操作過程中的注意點
1、上機前處理
小心熒光淬滅
操作時必須嚴格按照孵育時間，如果抗體孵育時間過長，熒光是會逐漸淬滅的。那如果不得不推遲實驗怎麼辦？可以把試管放在冰裡面，這樣會稍稍延長淬滅的時間。
注意染色順序
在進行多熒光染色的時候，相同的細胞會因為染色順序不同而導致熒光強度的差異。解決辦法為：預實驗。做一系列的不同染色順序的樣本，通過對染色前和染色後的各種樣本進行比較分析，判斷染色順序對細胞造成的影響。
選好染色方案
染色方案不合理也可能會導致熒光染色信號太弱。解決的方案：預實驗。在正式開始實驗之前，通過預實驗，設計出一個完美的染色方案。（考慮試劑種類，試劑質量，試劑用量，孵育時間，洗滌次數，染料濃度，染色時間及染色溫度等其他因素。）
做好陰性對照及同型對照試驗
細胞陰性對照可以顯示細胞基準的熒光水平。
同型對照則是為了查看抗體非特異性結合的水平。選擇同型對照需要注意採用相同物種、相同亞類、相同染料、相同濃度，否則，檢測的時候會出現亂七八糟的同型對照結果。
選擇合適的抗體
通用原則是：為表達最弱的抗原選擇染色指數最高的熒光素。根據使用的流式細胞儀性能、激光器、濾光片種類來選擇。對於多色實驗，需選擇發射光譜重疊小的染料。
2、參數設定
數據的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償等參數的設定會直接影響結果。
電壓
電壓的調節需根據陰性對照管來調節。
閾值
可以以任意參數及多個參數的組合作為閾值；大多數樣本都可以設定FSC/SSC；閾值以下的信號不存儲；可以根據陰性對照管來調節。
目的是將不需要的雜質信號，噪音信號，無用的細胞信號等扣除，使收集到的都是有用信號。
補償
流式細胞分析中經常要用到2種以上的熒游標記抗體進行染色，而目前所使用的多種熒光染料發射譜間有一定重疊。熒光補償則可以從探測器種除去匹配熒光以外的任何熒光信號。
補償方式：任意兩個通道之間都可以調節。
補償的調節：根據單染對照管來調節。
六、數據分析
流式細胞儀分析細胞的各種參數都是通過光信號來實現的。光信號包括了散射光信號和熒光信號。散射光信號包括前向角散射（FSC，反應細胞的大小）和側向角散射（SSC，反應細胞顆粒度）。熒光信號可以用來反應細胞的抗原表達等化學特性。
流式圖的種類非常多，最常用的是流式直方圖和流式散點圖。
直方圖
流式直方圖只能顯示一個通道的信息。
橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，單位是對數，可以是線性或對數坐標。縱坐標一般是細胞數。
散點圖
X坐標為該細胞一參數相對含量，Y坐標為該細胞另一參數的含量，可以將細胞亞群分開。
FSC和SSC是流式中兩個非常基本的參數，FSC的值能代表細胞的大小，細胞的體積越大，其FSC就越大。SSC則代表細胞的顆粒度，細胞內細胞器和顆粒度越大，則SSC越大。分析外周血細胞時，就可以利用FSC和SSC的特性把細胞分為淋巴細胞、單核細胞和粒細胞（左圖）。
右圖中可以看到X軸為CD3，Y軸為CD4，四個象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。
等高線和密度圖
等高圖：類似於地圖中的等高線，同一條線上的細胞數目相等，越在裡面的曲線代表細胞數目越多。
密度圖：點密度越大的地方細胞越多，點密度越小的地方細胞越少。
三維圖
Ⅱ 流式圖解析
1. 流式細胞術：是基於細胞或顆粒光學散射特點和熒光信號差異對單個細胞或顆粒進行統計分析的一種檢測方法。
2. 流式抗體：與普通抗體的不同，是偶聯熒光素的抗體.
表達某一抗原的細胞與偶聯熒光素的抗體特異性結合，經過流式細胞儀檢測區時熒光素被激光激發，發射出的熒光信號被接收。
分析時反推回去：某種熒光信號→某種流式抗體→某種抗原→某種細胞。
3. 流式圖：流式儀將接收到的光信號轉化為電信號，經計算機轉化為數字信號，繪製成圖呈現。
一、流式圖解析
1. 單參數直方圖
2. 雙參數散點圖
3. 等高線圖和密度圖
流式數據分析的過程實際上就是在流式圖上選門和設門的過程。
設門：是指用門選擇某一或某些特性的細胞，是定性細胞亞群的重要方法。可以是單一門，可以使邏輯門。
門：可以是任意形狀，可以封閉，可以開放（十字門）。門是人為設定的區域，有主觀性，所以要設置對照使更客觀。
設門需要考慮的因素——對照的設置
1). 必須有不染色的細胞作為空白對照
2). 抗原抗體的結合是否是特異性結合
a. 用同型對照判斷是否存在非特異性結合
b. 用Fc block阻斷細胞上的Fc受體非特異結合流式抗體
c. 用死活染料排除死細胞的干擾
3). 用陽性對照檢驗染色方案是否可行
4). 不同熒光素重疊光譜之間的補償，單染管對照，FMO對照。
1. 單參數直方圖
a.橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，可以是線性或對數坐標。
b.縱坐標一般是相對細胞數。
下圖中，細胞樣品染CD3 FITC抗體為例，通過橫坐標的熒光強度，把此細胞樣品分為兩群，左邊一群是CD3 negative，右邊一群是CD3 positive，進而我們可以知道此細胞樣品中CD3陽性細胞的比例是多少。
下圖是單參數直方圖的應用：
分群情況（下圖）：
第一張圖是：空白不染的細胞的檢測圖，
第二張圖是：一個樣本管，
第三張圖是：有兩個尖尖的峰頂，
第四張圖是：很明顯的兩個峰，
其中，第三張和第四張畫門正確，第二張圖畫門不正確，不能畫門，不能用百分比，應該用MFI值表示陽性群，因為圖二中群體比較均一。MFI中的M在大多數情況下是指mean值平均熒光強度。
mean,median,mode,Geom mean的區別：
mean是平均熒光強度，其缺點是：如果在當下視野里，細胞群體過大或過小，mean重復呈現性就會比較差。如果細胞群體都在視野里，可以用mean值。
median是熒光強度的中位數。100個細胞中50和51取個平均值。
mode是眾數，是一組數據中出現次數最多的數量。峰頂對應的熒光強度即眾數。
Geom mean是幾何平均數，是指n個觀察值連乘積的n次方根。
如果不是正態分布時，可以用Geom mean.
這四個值中，mean和Geom mean都可以代表整個細胞群的情況。mediun和mode只代表單一細胞的熒光強度。
選擇用哪個值，是根據流式圖的分布。在標準的高斯分布情況下，median=mean=mode，通常在流式中因為總會有異常值（超高或超低值）的存在，不是完美的高斯分布，建議使用medium，降低異常值對數據的影響。
2. 雙參數散點圖
散點圖比直方圖提供更多的信息。
等高線圖比散點圖更易分群。
橫坐標和縱坐標都是光信號，十字門左下角是雙陰性群，右下角和左上角是單陽群，右上角是雙陽群。散點圖上的每一個點可以代表某一個細胞的信息。
3. 等高線圖和密度圖（略）
4. 比較
二、補償調節
1.熒光素補償來源
a. adjacent detectors相鄰通道的補償：FITC和PE兩通道互相逸漏。
b. resial base fluorescence偶聯素相互之間的補償
c. similar emission spectra（cross-laser）不同激光器激發，但是因為光斑的影響，也會逸漏濾光片相鄰的兩個通道。
2. FITC compensation
先上未染色的細胞作為空白對照，以調節各個熒光通道的電壓；
然後單染管上樣，比如上樣FITC單染管，發現細胞群會飄到PE和percp-cy5.5通道里，會出現在雙陽區域Q2。
調節補償的原則：上誰的單染管就減去誰的通道里的光。
調完以後（下圖），細胞群只落到了FITC單陽區。
調補長需要注意：
1. 同質性：不同細胞自發熒光強度不同
2. 陰性群：必須要有陰性群體
3. 陽性群：陽性群數量不一定要很多，但是陰陽群體一定要分得開。
未完待續
Ⅲ FlowJo流式數據分析基礎——常見術語
FlowJo,由斯坦福大學Leonard Herzenberg實驗室在90年代推出的流式數據分析軟體，因其強大功能和易用性而備受科學家和實驗室青睞，成為各類高影響力期刊中引用率極高的工具。當我們使用FlowJo進行數據分析時，一些術語至關重要。首先，了解參數圖至關重要：
接著是門（Gate）的使用，有多種形式：
在數據統計方面，常用百分比和熒光強度(MFI)：
對於數據可視化，FlowJo支持峰圖和點圖的疊加，以及模擬分析，如細胞增殖、細胞周期和劑量效應分析。