『壹』 第二代基因測序產品研發主要面臨哪些問題
1）測序文庫構建（Library Construction）
首先准備基組（雖測序公司要求品量要達200ngGnome Analyzer系統所需品量低至100ng,能應用品限實驗）DNA隨機片段化幾百鹼基早爛棚或更短片段並兩加特定接（Adaptor）轉錄組測序則文庫構建要相麻煩些RNA片段化需反轉cDNA加接或者歷虛先RNA反轉cDNA再片段化並加接片段（Insert size）於面數據析影響根據需要選擇於陸則基組測序說通選擇幾種同insert size便組裝（Assembly）候獲更信息
2）錨定橋接（Surface Attachment and Bridge Amplification）
Solexa測序反應叫做flow cell玻璃管進行flow cell細8Lane每Lane內表面數固定單鏈接述步驟帶接DNA 片段變性單鏈與測序通道接引物結合形橋狀結構供續預擴增使用
『貳』 聽說基因管家用第二代測序技術做基因檢測准確率可以到99.5%，這是真的嗎
是的，第二代基因測序技術可以解羨亮裂讀30億的鹼基，數據量相當於60GB的「天書」（列印成兄閉冊相當於100本牛津大辭典），對個體攜帶的20000+個基因進行分析解讀，實現了真正意義上的個人基因組的全鍵銷面檢測，准確率達到了99.5%.
『叄』 科普講堂 | 一代、二代、三代基因測序技術大對比
測序技術是基因組學的核心技術，是基因組學最基本最重要的數據，也是生命科學領域大數據時代的核心組成部分。今天我來簡單盤點一代、二代、三代測序技術的優劣勢及應用情況。
一代測序是上世紀70年代由Sanger和Coulson開創的DNA雙脫氧鏈終止法測序，也稱為Sanger測序。在1977年完成第一個基因組序列（噬菌體X174），全長共計5375個鹼基。2001年完成的首個人類基因組圖譜就是以改進行塌知了的Sanger法為其測序基礎。
Sanger測序原理： 在4個DNA合成反應體系（含dNTP）中分別加入一定比例帶有標記的ddNTP（分為：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影後可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。由於ddNTP的2』和3』都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。
一代測序雖然准確度十分高，且該技術在當下依然被廣泛應用（比如構建載體做克隆，基因敲除等實驗都可以用到），但是通量太低，所以對於大片段或者全外顯子等非常耗時，且很多情況下成本較高。
二代測序技術，又稱為Next Generation Sequencing（NGS）技術，是為了改進一代測序通量過低的問題而出現的，能夠同時對上百萬甚至數十億個DNA分子進行測序，實現了大規模、高通量測序的目標。剛面世時主要包括Roche公司的454技術、ABI公司的Solid技術和Illumina公司的Solexa技術。這三種技術都極大的提高了測序的通量，大大降低了測序成本和周期。
其中Illumina公司憑借超低的測序成本和可以接受的讀長，成為了目前最主流的二代測序公司，其測序成本近五年來從幾千元1G（1G即10億鹼基）降到了到今天的40多塊錢1G數據量，這個過程中基因組 De novo 測序、轉錄組測序、小RNA測序、LncRNA測序、circRNA測序、DNA甲基化測序、高密度遺傳圖譜、大規模GWAS關聯分析等等實驗手段得到了廣泛的推廣應用。近年來，NGS技術發展迅速，其應用已進展至臨床檢測，如無創產前、遺傳性疾病，腫瘤（實體/血液）等。
Illumina 原理： 橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像。
主要步驟：
1、DNA文庫制備——超聲打斷加接頭；
2、Flowcell——吸附流動DNA片段；
3、檔消橋式PCR擴增與變性——放大信號；
4、測序——測序鹼基轉化為光學信號衫吵。
二代測序技術雖然通量很高，成本低廉，但是讀長實在太短，主流的Illumina測序儀，常規模式只能測PE150的長度，靠著軟體演算法上的進步才得以可用。由此三代測序走上了歷史舞台。
三代測序主要有兩種技術：PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術，這兩種技術的測序讀長都可以達到幾十kb的級別，遠遠高於二代測序技術。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。實現了對每一條DNA分子的單獨測序。單分子測序可以更准確地檢測串聯重復擴增等。這對於無參物種的分子生物學研究大有幫助，長讀長對於基因組拼接、全長基因序列的獲取提供了巨大的便利。
Pacific Biosciences公司研發的單分子實時測序系統（Single Molecule Real Time，SMRT）應用了邊合成邊測序的原理，並以SMRT晶元為測序載體。基本原理如下：
1、聚合酶捕獲文庫DNA序列，錨定在零模波導孔底部；
2、4種不同熒游標記的dNTP隨機進入零模波導孔底部；
3、熒光dNTP被激光照射，發出熒光，檢測熒光；
4、熒光dNTP與DNA模板的鹼基匹配，在酶的作用下合成一個鹼基；
5、統計熒光信號存在時間長短，區分匹配鹼基與游離鹼基，獲得DNA序列；
6、酶反應過程中，一方面使鏈延伸，另一方面使dNTP上的熒光基團脫落；
7、聚合反應持續進行，測序同時持續進行。
但是三代仍然不是完美的技術，其測序錯誤率相對於一代和二代還是高了很多，另外通量還是遠低於二代測序，導致成本也是數倍於二代測序。
胡潤 | 文案
『肆』 測序原理：一代二代三代測序原理詳解
雙脫氧鏈終止法採用DNA復制原理。 Sanger測序反應體系中包括目標DNA片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測序引物及DNA聚合酶等。 測序反應的核心就是其使用的ddNTP：由於缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或熒游標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。
Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa/Hiseq技術和ABI公司的SOLID技術標志第二代測序技術誕生。其中Roche公司的454測序系統是第二代測序技術中第一個商業化運營的測序平台。
其中Illumina市場規模佔到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介紹它的PE（Pair End雙端）測序原理：
名詞：
flowcell： 測序反應的載體/容器，1個flowcell有8個lane
lane： 測序反應的平行泳道，試劑添加、洗脫等過程的發生位置
tile： 每次熒光掃描的位置，肉眼是看不到的
雙端測序： 可能序列比較長有四五百bp，兩邊各測120-150bp
junction： 雙端鬧行測序中間一些沒有測到的區域
index(barcode)：一個lane通常要測多個樣品，每個樣品都加上特定的序列標簽，用於區分不升橘同樣品。
flowcell構造：一個lane包含兩列（swath），每一列有60個tile，每個tile會吵彎團種下不同的cluster，每個tile在一次循環中會拍照4次（每個鹼基一次）
打斷以後會出現末端不平整的情況，用酶補平，所以現在的序列是平末端。
完成補平以後，在3'端使用酶加上一個特異的鹼基A，加上A之後就可以利用互補配對的原則，加上adapter，這個adpater可以分成兩個部分，一個部分是測序的時候需要用的引物序列，另一部分是建庫擴增時候需要用的引物序列。
進行PCR擴增，使得我們的DNA樣品濃度足夠上機要求。
reads1 與 reads2 不發生重疊
flowcell是用於吸附流動DNA片段的槽道，測序就在此進行。上面構建好的文庫中的待測序列事先配置好一定的濃度，經過這里的時候，會在特異的化學試劑作用下，強力隨機地附著在lane上，與上面的短序列配對。上樣的結果就是lane吸附住了沖過來的DNA，並且可以在表面進行橋式PCR擴增。
雙端測序之Forward Strand ：
為什麼Illumina測序會有長度限制呢？
Hiseq2000測序儀
測序儀搭配了兩個flowcell，簡稱雙流動槽。比較經典的Hiseq2500一次能產出700-800Gb數據（此處Gb為測序鹼基數，不同於位元組數的Gb）
數據量=單端reads長度 * 單端reads個數 * 2（PE)
測序深度=數據量大小 / 參考基因組大小
這是一個新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術為標志，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比，最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，超長讀長，平均達到10Kb-15Kb，是二代測序技術的100倍以上，值得注意的是在測序過程中這些序列的讀長也不再是相等的。
1. https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2
2. https://zhuanlan.hu.com/p/20702684
3. https://mp.weixin.qq.com/s/tWHWA-f1RnP_XWY66p12pg
4. https://mp.weixin.qq.com/s/9KUY43lD5miLdPZJKgRV0A
『伍』 二代測序為什麼有的用G有的用reads代表測序深度
二代戚廳測序中G就是Gb跟硬碟的Gb一樣，因為數據量非常大，所以一般都用多少G來生命測序得到的鹼基數據。reads是指讀出的短序列、短片段。測序深度一般用數字加乘號來表示比如100X這樣。表示測序實際得到的有效鹼基數據比模板實際鹼基數據。
二代測序技術可以幫助發現新的治療靶點，可以是新基因上的新靶點，也可以是已知基因上的耐葯靶點；還可以幫助患者選擇更好的治療方式，這在靶向治療和免疫治療時代顯得尤為重要；最緩山後它還可以幫助預測癌症的復發，以及篩查早期癌症。
想要了解更多有關基因檢測的相關信息，推薦咨詢海普洛斯。旗下醫學檢驗實驗室具有國際頂尖基因測序平台以及完善的國際標准質量體系，通過CAP(美國病理學家協高哪隱會)/EMQN(歐洲分子基因診斷質量聯盟)/中國衛生部臨檢中心等權威認證，業務覆蓋腫瘤全病程管理、遺傳性疾病篩查、重大感染性疾病（含新冠核酸）等領域，已為全國500多家三甲醫院、數百家科研院所、體檢機構、保險公司、互聯網平台以及各地政府提供基因檢測技術服務和整體解決方案。【● 沒病有必要做基因檢測嗎？過來人有話說......】
『陸』 病原學宏基因檢測二代測序費用多少
看你需要的數據量，6-10G數據量/樣，大概300-500吧，不同的服務公司價格有差別
『柒』 為什麼二代測序又叫深度測序
在二代測序中,為了有效覆蓋全基因組,獲得的數據量一般是被測基因組的頌桐幾十倍,然後再拼接.
也就是說,理論上,每個位點都要被覆蓋幾十次甚至上喚櫻耐百次和春,這個次數就叫測序深度
所以,二代測序也成為深度測序
『捌』 第二代測序技術能測基因組全長嗎
第二代測序技術能測基因組全長
測序文庫的構建（Library Construction）
首先准備基因組（雖然測序公司要求樣品數鄭迅量要達到200ng，但是Gnome Analyzer系統所需的樣品薯此量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中），然後將DNA隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段，並在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）。如果是轉錄組測序，則文庫的構建要相對麻煩些，RNA片段化之後需反轉成cDNA，然後加上接頭，或者先將RNA反轉成cDNA，然後再片段化並加上接頭。片段的大小（Insert size）對於後面的數據分析有影響，可根據需要來選擇。對於基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insert size，以便叢吵在組裝（Assembly）的時候獲得更多的信息。
『玖』 基因組測序的測序深度一般是多少
基因組測序的測序深度一般是10X。
測序深度是指測序得到的總鹼基數與待測基因組大小的比值。假設一個基因大小為2M，測序深度為10X，那麼獲得的總數據量為20M。
基因測序是一種新型基因檢測技術，能夠從血液或唾液中分析測定基因全序列，預測罹患多種疾病的可能性，個體的行為特徵及行為合理，如癌症或白血病，運動天賦，酒量等。