做流式活細胞佔比多少數據可靠

❶ 流式細胞分析術的工作原理

流式細胞計是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特徵參量，並可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數流式細胞計是一種零解析度的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節 解析度為零。國外又把流式細胞計稱作熒光激活細胞分選器(Flu-orescence Activated CellSorter,FACS)。美國Becton—Dickinson 公司生產的流式細胞計系列均冠以FACS字頭。目前中國國內使用的儀器多為美國、西歐及日本等國的產品，國內有些單位也已研製成功，但尚無定型產品面市。
流式細胞計的基本結構流式細胞計組成
它們是：流動室和液流系統；激光源和光學系統；光電管和檢測系統；計算機和分析系統。
⑴流動室和液流系統：流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透明、穩定的材料製作。設計和製作均很精細，是液流系統的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周後從噴嘴射出。為了保證液流是穩液，一般限制液流速度υ<10m/s。由於鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振盪信號可發生振動。
⑵激光源和光學系統：經特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發才能發出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據被激發物質的激發光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發射光譜大部分集中於300～400nm,很適合需要用紫外光激發的場合。氬離子激光器的發射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發生改變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，則可得到550～650nm連續可調的激光，尤在590nm處轉換效率最高，約可佔到一半。為使細胞得到均勻照射，並提高解析度，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調整反射鏡的角度使調諧到所需要的波長λ。為了進一步使檢測的發射熒光更強，並提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC(Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就採用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
⑶光電管和檢測系統：經熒光染色的細胞受合適的光激發後所產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增管(PMT)最為常用。PMT的響應時間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200～900nm的光譜區，光量子產額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續調節 ，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩定性問題，工作電壓要十分穩定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低於0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應處理，並注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT,因為光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極體的，它在強光下穩定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經過放大後才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關系，稱為線性放大器。線性放大器適用於在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差1～2個數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器採集數據易於解釋。此外還有調節 便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優點。
⑷計算機和分析系統：經放大後的電信號被送往計算機分析器。多道的道數是和電信號的脈沖高度相對應的，也是和光信號的強弱相關的。對應道數年縱坐標通常代表發出該信號的細胞相對數目。多道分析器出來的信號再經模-數轉換器輸往微機處理器編成數據文件，或存貯於計算機的硬碟和軟盤上，或存於儀器內以備調用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數。存貯於計算機內的數據可以在實測後離線重現，進行數據處理和分析，最後給出結果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。
參數測量、樣品分選及數據處理
⑴參數測量原理：流式細胞計可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特徵性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於光學性質的改變，其散射光信號當然不同於活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。
在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射(FSC)；②側向散射(SSC)，又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對於形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。
在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射後所發出的熒光；②特徵熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為雜訊信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對於結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。
減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統；③採用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。
⑵樣品分選原理：流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而後由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有採用捕獲管來進行分選的。
穩定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數百μm。實驗經驗公式f=v/4.5d給出形成穩定水滴的振盪信號頻率。其中v是液流速度,d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V,或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈沖發生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數十ms。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，儀器多採用移位寄存器數字電路來產生延遲。可根據具體要求予以適當調整。
(50)數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至於對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。
①數據顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖(histogram)、二維點圖(dot plot)、二維等高圖(contour ）、假三維圖(pseudo 3D)和列表模式(list mode)等。
直方圖是一維數據用昨最多的圖形顯示形式，既可用於定性分析，又可用於定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據選擇放大器類型不同，橫坐標可以是線性標度或對數標度，用「道數」(Channel No .）來表示，實質上是所測的熒光或散射光的強度。縱坐標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數與細胞之間的關系是它的局限性。
二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系。橫坐標和縱坐標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應坐標植的細胞存在（圖10-3)。可以由二維點圖得到兩個一維直方圖，但是由於兼並現象存在，二維點圖的信息量要大於二個一維直方圖的信息量。所謂兼並就是說多個細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難於顯示它的精細結構。
二維等高圖類似於地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即「等高」。曲線層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。
假三維圖是利用計算機技術對二維等高圖的一種視覺直觀的表現方法。它把原二維圖中的隱坐標—細胞數同時顯現，但參數維圖可以通過旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀察「山峰」和「谷地」的結構和細節 ，這無疑是有助於對數據進行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。
列表模式其實只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數數據顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用List Mode中的特殊技術，開窗或用游標調出相關部分再改變維數進行顯示。例如，「一調二」就是在一維圖上調出二維圖來；「二調一」就是從二維圖中調出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。
上面簡要地介紹了幾種數據顯示形式，在實際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數據分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型技術時則多使用參數方法。數學模型可以是一個方程或方程組，方程的參數產生所需要的信息來自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分布。如果採用正態分布函數來描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標准偏差。方程的數據擬合則通常使用最小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設，即採用無設定參數分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數分布；也可能很復雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。
逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統）是大家常用的數據分析的重要手段。我們常可以用來了解數據的特性、尋找那些不曾預料的特異徵兆、選擇統計分析的模型、顯示最終結果等。事實上，不經過先對數據進行直觀觀察分析就決不應該對這批數據進行數值分析。從這一點來看，非參數分析是參數分析的基礎。
逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設置應根據整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到「差結果曲線」往往是適宜的。
因為數據分析往往和結果解釋關系十分密切，也就是說和生物學背景相關，因此具體的分析法和原理將在後面結合實例再介紹。
流式細胞計的技術參數 為了表徵儀器性能
往往根據使用目的和要求而提出幾個技術參數或指標來定量說明。對於流式細胞計常用的技術指標有熒光解析度、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數等。
⑴熒光解析度：強度一定的熒光在測量時是在一定道址上的一個正態分布的峰，熒光解析度是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異系數(C.V值）來表示。C.V的定義式為：
C.V=σ/μ
式中，σ為標准偏差，μ是平均值。
在實際應用中，我們使用挖關系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光解析度均優於2.0%。
⑵熒光靈敏度：反映儀器所能探測的最小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC(fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素）的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。
⑶分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。
⑷樣品濃度：主要給出儀器工作時樣品濃度的適用范圍。一般在1010細胞/ml的數量級。
其它技術參數尚多，不再一一介紹。
流式細胞計的調試和使用
古語說：「工欲善其事，必先利其器」。要想很好地應用流式細胞分析和分選技術，必需先對儀器進行調試，使其處於良好的工作狀態，並能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調試項目及要點、使用的程序等等。
⑴調試和校準：流式細胞計在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調試，以保證工作的可靠性和最佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區的光路等。
激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。
液流速度：可通過操作台數字顯示監督，調節 氣體壓力大小以獲得穩定的液流速度。
測量區光路調節 ：這是調試工作的關鍵。需要保證在測量區的液流、激光束、90散射測量光電系統垂直正交，而且交點較小。一般可在用標准熒光微球等校準中完成。
流式細胞術中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標准樣品應該穩定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經濟、容易獲得。常用標准熒光微球作為非生物學標准樣品，雞血紅細胞做為生物學標准樣品。微球用樹脂材料製作，或標有熒光素，或不標記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強度葯盒，在免疫實驗中可用來作為定量熒游標准來測定每個細胞所標記的抗原位點數目。所用的雞血紅細胞標准樣品製作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4)，經PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗後的雞紅細胞混合，室溫下振盪醛化24h,最後經PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發熒光。
⑵儀器的操作和使用：
①打開電源，對系統進行預熱；
②打開氣體閾，調節 壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統；
③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統；
④利用校準標准樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上,0和90散射的熒光強度最強，並要求變異系數為最小；
⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；
⑥樣品測量完畢後，再用去離子水沖洗液流系統；
⑦因為實驗數據已存入計算機硬碟（有的機器還備有光碟系統，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；
⑧將所需結果列印出來。
在操作和使用中一定要注意如下事項：
1)光電倍增管要求穩定的工作條件，暴露的較強的光線下以後，需要較長時間的「暗適應」以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
2)光源不得在短時間內（一般要1h左右）關上又打開；使用光源必須預熱並注意冷卻系統工作是否正常；
3)液流系統必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經過過濾、消毒；
4)注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類型等；
5)特別強度每次測量都需要對照組。

❷ MTT細胞存活率與流式檢測的活細胞率是對應的嗎

要看你流式用的是哪種方法了。

如果單用PI染色，陽性的就是死細胞。細胞膜受損。
如果用Invitrogen的Live/Dead方法，死細胞和活細胞都能分別染色。活細胞內ATP充分。酶還有活性。可以產生熒光物質。死細胞的細胞膜損壞，導致DNA被染色。

理論上比例應該接近，但是原理不是完全相同。所以結果會有一些差別。

❸ 流式細胞術的作用原理

流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，並能同時從一個細胞中測得多個參數，與傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、准確性好等優點。

將待測細胞染色後製成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷流式細胞術酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。

流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形後的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極體和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收後可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，也可以列印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬碟上以備日後的查詢或進一步分析。

檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的解析度有512或1024通道數，這視其模數轉換器的解析度而定。對於雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。

細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電後振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。

❹ 流式細胞術：原理、操作及應用的目錄

序
前言
1 概述
1.1 流式細胞術基本概念
1.2 分析型流式細胞儀介紹
1.3 分選型流式細胞儀介紹
參考文獻
2 流式細胞儀的原理
2.1 液流系統
2.2 光路系統
2.3 檢測分析系統
2.4 分選系統
參考文獻
3 流式圖
3.1 流式通道
3.2 流式直方圖
3.3 流式散點圖
3.4 流式等高線圖
參考文獻
4 流式細胞術的基本操作與技巧
4.1 樣品制備
4.1.1 獨立細胞樣品制備
4.1.2 免疫器官樣品制備
4.1.3 實體臟器樣品制備
4.2 熒光素偶聯抗體及其標記方法
4.2.1 熒光素
4.2.2 熒光素偶聯抗體
4.2.3 樣品封閉
4.2.4 熒光素偶聯抗體標記
4.3 光電倍增管電壓設定
4.4 對照的設置
4.4.1 陰性對照的設置
4.4.2 FM.對照
4.4.3 陽性對照的設置
4.5 補償調節
4.5.1 補償調節的原理
4.5.2 調節補償的具體方法
4.5.3 三色和四色分析補償調節方法
4.5.4 影響補償大小的因素
4.6 閾值設定
4.7 流式分析中的死細胞問題
4.7.1 減少樣品中死細胞比例的方法
4.7.2 流式分析時區分死細胞和活細胞的方法
4.8 流式分選模式選擇
4.8.1 純化模式
4.8.2 富集模式
4.8.3 單細胞模式
4.9 上樣速度控制
4.9.1 流式分析速度控制
4.9.2 流式分選速度控制
4.10 分選設門基本原則
4.11 流式分選基本步驟
參考文獻
5 流式分析術的應用
5.1 細胞群比例測定
5.2 表型測定
5.3 檢測細胞因子
5.3.1 胞內染色法檢測細胞因子
5.3.2 胞內染色法與ELISA法比較
5.3.3 CBA法測定細胞因子
5.3.4 CBA法與ELISA法比較
5.4 檢測細胞增殖
5.4.1 相對計數法
5.4.2 示蹤染料標記法
5.4.3 Br標記法
5.4.4 其他方法
5.5 檢測細胞凋亡
5.5.1 annexinV/PI雙染色法
5.5.2 SYTO/PI雙染色法
5.5.3 細胞：DNA含量分析法檢測細胞凋亡
5.5.4 線粒體損傷檢測法
5.5.5 活化的caspase-3檢測法
5.5.6 熒光素偶聯的caspase抑制劑(FLICA)標記法
5.5.7 甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法
5.5.8 TUNEL法
5.6 檢測細胞周期
5.6.1 非特異性核酸熒光染料標記法
5.6.2 特異性細胞周期調節蛋白檢測法
5.7 檢測細胞殺傷能力
5.8 檢測細胞吞噬功能
5.9 檢測胞內活化的激酶
5.10 檢測基因表達
5.10.1 GFP報道基因系統
5.10.2 JocZ報道基因系統
5.10.3 內醯胺酶報道基因系統
5.11 微生物學中的應用
5.11.1 熒光素偶聯抗體直接檢測法
5.11.2 抗體結合人工熒光微球直接檢測法
5.11.3 微生物活性流式檢測
5.11.4 人工微球熒光免疫試驗檢測抗體
5.11.5 熒光原位雜交流式檢測法
5.11.6 PCR免疫微珠法
5.11.7 原位PCR雜交流式檢測法
5.12 檢測鈣相關分子
5.12.1 檢測細胞內游離的鈣離子水平
5.12.2 檢測鈣蛋白酶活性
5.12.3 檢測細胞膜鈣泵活性
5.13 表觀遺傳學中的應用
5.13.1 ChIP一0n-beads法
5.13.2 檢測細胞水平組蛋白修飾情況
……
6 流式分選術的應用
參考文獻

❺ 流式細胞術中的「鬼」故事（引子）

萬聖節快到了，讓我們聊點靈異的話題。

大家在做流式細胞術的時候會遇到很多和死活細胞有關的故事。

例如下面的一些小故事，不知道大家有沒有遇到過？

我們一起來看看吧。

故事一，有時我們在流式細胞儀上樣的時候，有的樣本細胞已經死了，但是有的樣本類型細胞還活著。

故事二，明明已經都染了很多熒光染料了，根據SOP還要再對死細胞染色，為什麼呢？只是導師錢多用來花式炫富的么……

故事三，染個死細胞，共聚焦裡面DAPI細胞核都染的好好的，怎麼在流式細胞儀上就不靈了呢？

故事四，為啥我的生物樣本，用PI染色，活細胞的PI的MFI（平均熒光強度）比死細胞還高？

故事五，我做細胞內染色，細胞即將要固定破膜，那麼我區分死細胞還能使用PI或者7AAD么？

故事六，為啥我去約分選，分選老師知道我的樣本內加入了PI用於去死細胞之後，他有點不想讓我約儀器？

故事七，顯微鏡下可以觀察到死細胞發生了細胞體積的膨脹，明明比活細胞的直徑大，為啥死細胞的FSC(前向散射信號)要比活細胞小，FSC不是反應細胞的相對大小么？我這是除了在顯微鏡下看到了死細胞，難道還看到鬼了么？

故事八，為啥做T細胞分化實驗，隔壁實驗室的猥瑣師兄每次做的結果都那麼好，而用他的誘導條件，我們所的其它相關實驗室都重復不出來，難道他有霍格沃茲y的學位證書？

故事九，導師讓我幫實驗室訂購在流式細胞儀上用於區分死活細胞的熒光染料，哎呀，我的這個選擇困難症又犯了，我要休假，不對，我覺得我需要搶救一下……

不知道大家有沒有成為上面故事中的主角，或者大家本身還有其它與死細胞更好玩的小故事，歡迎大家在下面留言分享。

❻ 流式細胞儀的原理是什麼

流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特徵性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於光學性質的改變，其散射光信號當然不同於活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。

在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對於形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射後所發出的熒光；②特徵熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為雜訊信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對於結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。

減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統；③採用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。

樣品分選原理流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而後由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有採用捕獲管來進行分選的。

穩定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數百μm。實驗經驗公式f=v/4.5d給出形成穩定水滴的振盪信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈沖發生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數十ms。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，儀器多採用移位寄存器數字電路來產生延遲。可根據具體要求予以適當調整。

（50）數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至於對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

①數據顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。

直方圖是一維數據用作最多的圖形顯示形式，既可用於定性分析，又可用於定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據選擇放大器類型不同，坐標可以是線性標度或對數標度，用「道數」來表示，實質上是所測的熒光或散射光的強度。坐標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數與細胞之間的關系是它的局限性。

二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系。坐標和坐標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應坐標值的細胞存在。可以由二維點圖得到兩個一維直方圖，但是由於兼並現象存在，二維點圖的信息量要大於二個一維直方圖的信息量。所謂兼並就是說多個細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難於顯示它的精細結構。

二維點圖二維等高圖類似於地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即「等高」。曲線層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。

假三維圖是利用計算機技術對二維等高圖的一種視覺直觀的表現方法。它把原二維圖中的隱坐標—細胞數同時顯現，但參數維圖可以通過旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀察「山峰」和「谷地」的結構和細節，這無疑是有助於對數據進行分析的。

假三維圖列表模式其實只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數數據顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用ListMode中的特殊技術，開窗或用游標調出相關部分再改變維數進行顯示。例如，「一調二」就是在一維圖上調出二維圖來；「二調一」就是從二維圖中調出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。

圖10-6從二維圖設窗調出直方圖示意上面簡要地介紹了幾種數據顯示形式，在實際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。

②數據分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型技術時則多使用參數方法。數學模型可以是一個方程或方程組，方程的參數產生所需要的信息來自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分布。如果採用正態分布函數來描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標准偏差。方程的數據擬合則通常使用最小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設，即採用無設定參數分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數分布；也可能很復雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。

逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統）是大家常用的數據分析的重要手段。我們常可以用來了解數據的特性、尋找那些不曾預料的特異徵兆、選擇統計分析的模型、顯示最終結果等。事實上，不經過先對數據進行直觀觀察分析就決不應該對這批數據進行數值分析。從這一點來看，非參數分析是參數分析的基礎。

逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設置應根據整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到「差結果曲線」往往是適宜的。

因為數據分析往往和結果解釋關系十分密切，也就是說和生物學背景相關，因此具體的分析法和原理將在後面結合實例再介紹。

❼ 流式細胞術的應用范圍

隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用 階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。可用於白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，並已開始用於細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的記數。
自70年代以來，隨著流式細胞技術水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用於免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。
在腫瘤學中的應用
這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色後對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。
(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處於量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助於癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。隨著細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標志。
(2)在腫瘤的診斷、預後判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預後的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預後則較好。
FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療葯物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的葯物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。
此外FCM近幾年還被應用於細胞凋亡和多葯耐葯基因的研究中[3，4]。醫學工作者開始研究如何用葯物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多葯耐葯是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多葯耐葯基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。
在臨床中的作用
FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析，進行細胞分類和亞群分析。這一技術對於人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植後病人的腎排斥反應，如果T4/T8比例倒置，病人預後良好，較少發生腎排異現象；反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用於艾滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值，並對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討[5]。
目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百餘種，可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。
在血液病診斷和治療中的應用
FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預後判斷和治療起著舉足輕重的作用。
(1)白血病的診斷和治療：FCM採用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，藉助於各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用[6]。例如幹細胞表達CD34，髓系表達CD13、CD14，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測定出血細胞表達各種抗原的水平，協助臨床確診。
同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況採取相應葯物可以提高療效。
目前臨床除化療葯物治療外還採用造血幹細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體幹細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血幹細胞移植技術主要包括幹細胞的鑒別、活性測定、幹細胞動員和採集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、幹細胞回輸以及術後保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為幹細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預後做出早期的判斷。
(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿症是一種造血幹細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬於血細胞表面磷脂醯肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM採用熒游標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷並判斷疾病的嚴重程度[8]。
(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高[9]。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義[10]。為幹細胞移植術後恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。
在血栓與出血性疾病中的應用
(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由於血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果採用全血法測定，只需微量標本，適合於兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒游標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利於血栓栓塞性疾病的診斷和治療。
此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，藉助於鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用於該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。
質量控制
一、流式細胞儀的校準
流式細胞儀的校準包括流路的穩定性、光路的穩定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩定性。對儀器的校準主要是利用標准微球進行監測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒游標記或者擁有定量免疫球蛋白的結合位點。這種製成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質控中的一個常用的標准品。
二、實驗操作過程的質控
1、樣本的質量控制
用於流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質控最困難的環節之一。每種樣本都有不同的採集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應棄用。
第二，單細胞懸液的獲取：外周血和骨髓穿刺液為天然單細胞懸液；活檢組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對於需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。
第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可採用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數和流式分析，則應用EDTA抗凝；對於血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由於相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。
第四，樣本的保存：理想狀態下，樣本應在採集後立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對於只作胞內染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此「固定－染色」的方法取決於要分析的抗原特性和染色方式。
第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、並最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色後溶血。若在染色前溶血，需確認：（1）抗原性不被溶血過程改變；（2）溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動力反應未受影響；（3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結果。密度梯度離心法，靶細胞回收較好並可能得到富集，同時去除紅細胞、碎片等，但費時，某些重要細胞群體可能被選擇性丟失。
第六，細胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細胞數量在5X105 ~1x106范圍內。有些標本沒有足夠的細胞，有些則由於細胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導致假陽性或假陰性結果。因此，每個實驗室應根據不同於廠家推薦的方法，調整細胞與抗體用量，得到最適的細胞/抗體比例。
第七，細胞活性的鑒定：死細胞對許多抗體均有很強的非特異性染色，這就使樣本細胞活性檢測變得非常重要，尤其是經過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種：（1）實時的流式檢測：利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）進行死細胞染色，而活細胞拒染這些染料。此方法的優勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行。尤其適用於高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因為在488nm激發下，其最大發射光在670nm左右，適合與FITC 或PE進行多色標記。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區分變得困難。因此，對於染色並在固定後12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩定的共價結合保證了長時間固定後仍能很好地區分固定前的死活狀態。（2）手工檢測：使用Trypan blue 或其他細胞活性染料。（3）使用專門的儀器進行檢測。如Vi-cell.
2、選擇和確定單抗組合
流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則：1）所選的抗體組合應足夠寬，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達少的抗原應盡可能選擇熒光強度強的熒光素標記。3）了解不同抗體的細胞反應譜，以及染色模式。根據不同的實驗目的選擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結合（如通過空間構型的阻礙），所以對所用抗體組合，應先了解每個抗體在對照細胞上單色標記的表達情況。5）對於臨床實驗盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用於體外診斷實驗。在我國，用於體外診斷的試劑還必須取得國內的SDA認證。這樣，一個抗體組合內的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那麼，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對於臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。
如，T細胞亞群檢測的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發性血紅蛋白尿（PNH）檢測的CD55、CD59；血小板無力症（GT）檢測的CD41、CD61等等。但對於白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止也沒有統一的抗體組合。在2000年國際細胞分析學會（ISAC）大會上，臨床血細胞計數協會組織了一次國際專家會議，以期對檢測血液淋巴系統腫瘤所需最少、最有效的單抗數達成共識。75%與會者一致認為，對於慢性淋巴系統增殖性疾病（CLD）有9種單抗：CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對初診來說是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對於急性白血病（AL），75%的與會者認為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對初步鑒別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對某些病例有用。幾乎所有的投票者都認為，要對急性白血病完善分類所需單抗的恰當數量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無統一規定（如表二）。大會多數發言者(11/13)指出，對已確診病人的監護和分期來說，僅需較少單抗。
抗體的質量控制是實驗的關鍵環節。抗體的質量包括其特異性、靈敏度、精密度。對這一些，一些商業化的公司對常用單抗的檢驗均推出了一系列質控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見表一）。
3、染色方法
細胞表面染色：大多數免疫表型分析均採用此方法。但由於許多抗原也同時存在細胞內，所以在細胞表面抗原檢測時應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。表面標記又分溶血前標記和溶血後標記。若紅細胞對標記有影響或血漿成分對標記有影響的，適合溶血後標記，但要注意溶血劑膜抗原的影響，所以，溶血劑一般不含固定劑。如免疫球蛋白輕鏈檢測和陣發性血紅蛋白尿的檢測等。
細胞內染色：有些胞內抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞內染色的關鍵是使細胞膜通透，把抗體或核酸染料導入胞內而不影響細胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關抗原與相應抗體的結合力和核酸與染料的結合。某些適用於胞內染色的試劑可能不適於表面標記分析。通常胞內染色不能與細胞活性的檢測同時進行，除非用EMA的方法。對於胞內染色，所用的熒光素應足夠小到能穿透到胞膜內。對於某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細胞染料，無需固定或透膜。
胞膜和胞內染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最後是DNA染色。
三、數據的獲取和分析
流式細胞儀數據的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。由於流式細胞儀是基於對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償等參數的設定直接影響結果。同型對照的設定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽性閾值的界定才比較准確，特別是對於弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體分析中參照物的設定非常重要，一般雞紅細胞作為內參照物。為了結果的可靠性，對獲取的細胞量至少應在10000-20000個。但不同的實驗目的對於獲取的細胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應獲取10000個細胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測，要求達到10-4數量級水平，則應至少分析100000個細胞幹細胞移植中CD34的檢測，應至少獲取100個CD34陽性細胞或75000個有核細胞。
對於獲取的數據，應保存在listmode文件中，便於分析。設門（gating）對於流式數據分析至關重要。設門實際就是確定分析區域。在DNA倍體分析中，設門實際就是圈定單個細胞，排除粘連細胞。對於細胞成分單一的標本（如培養細胞），設門比較簡單。但對於成分復雜的標本（如骨髓）而言，准確的設門就不那麼簡單。前向散射光（FS）與側向散射光（SS）設門干擾因素較多，目前，越來越多的被免疫標記物加散射光設門所取代。如，CD45/SS設門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測、MRD監測最佳的設門方法；CD19/SS設門對於成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。
在數據分析中，百分率、熒光強度、DNA指數（DI）、多少個/ul是我們報告中常用的。百分率主要適用於檢驗指標集中在細胞有無的數量變化。如T細胞亞群檢測、網織紅細胞檢測等；熒光強度主要適用於檢驗指標的變化集中在細胞上抗原量的多少。如血小板無力症（GT）的檢測、慢性淋巴細胞白血病（CLL）CD20的變化等。DI用於DNA倍體分析。而艾滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監測中CD3的絕對定量、幹細胞移植中的CD34的定量等等，最終都以多少個/ul的濃度形式表示出來。對於白血病/淋巴瘤免疫分型結果的分析，以前基本上都是以百分率的形式報告臨床，但單純的百分率結果並不能完整的反映腫瘤細胞的特性。因為20%人為認定的陽性判斷標准忽略了低於20%的弱陽性結果，以及忽略了陽性結果之間熒光強弱的差別，而這一切對於白血病/淋巴瘤的診斷和分型卻非常重要。目前，大多主張以文字描述抗原有無和強弱的報告方式，廢棄百分率的報告形式。
四、臨床檢驗的分析過程的質量評價
質量控制也必須重視檢驗方法學的選擇和評價。任何一次實驗都一定有誤差，在一定意義上可以將誤差分為實驗方法學的系統誤差及除此之外的隨機誤差。質量控制的方法和手段都只能減少或消除隨機誤差，但不影響系統誤差。要使檢驗結果的誤差控制在臨床可接受的低水平或者允許的誤差范圍內，必須使用總誤差水平符合臨床要求的檢驗方法（包括儀器、試劑、具體操作方法等），才能保證檢驗結果在質量控制下符合臨床要求。臨床檢驗質量控制的目的，是監測實驗過程中出現重要的誤差時，用適當的方法警告分析人員。一般說來，檢查實驗結果質量的方法是測定質控物，最通用做法是將質控品和病人一起進行常規檢驗，了解檢驗質量則是將質控品測定的結果畫在控制圖上，觀測控制結果是否超過控制限來決定失控與否。
在開始使用質控物的第一個月內，檢驗人員每天將質控物隨機插入病人標本中進行檢驗項目的測定。月末對當月的測定結果（n≥20）做簡單統計，求出均值x和標准差s。若檢驗結果的分布接近正態分布，結果的分布即可用均值和標准差來描述。這就意味著95.5%的結果在x+2s范圍內,99.7%的結果在x+3s范圍內。為便於觀察質控結果，及時了解有何失效情況，常使用質控圖。
按照正態分布規律：1)所有測定值應均勻分布於均值兩側，不應有明顯不均之感；2)質控品測定值應有95.5%的可能性在x±2s范圍之內； 3)不應有連續6次以上的結果落於平均值的一側；4)不能有連續5次以上的結果有逐漸增高或降低的趨勢性變化;5)不應有連續兩次結果在x±2s范圍之外； 6)沒有一次結果在x±3s范圍之外。
如果不符合上述規律，則說明結果失控。只有證實當天質控結果在控制之內,對當天的臨床檢驗才能發出結果。一旦出現失控,則須查明原因，重新檢驗。對有1次檢驗結果超出均數2個標准差范圍，提示警告。同批實驗中2個質控品的結果之差值超過4s，也是失控規則之一，提示存在隨機誤差。連續4次質控結果同方向超出均數1個標准差范圍，也是失控規則之一，提示存在系統誤差。
五、室間質量評價
開展內部的質量控制使實驗的受控項目達到一定的精密度。臨床上往往只對實驗結果是否可重復較敏感，若實驗結果存在較穩定的系統誤差，臨床和實驗室一般不易察覺，因此內部的質量控制還在於控制結果的不精密度。由專門機構定期向臨床實驗室分發質控品,要求各單位檢測後返回測定結果，經過整理和統計，以數據和報告形式反映各實驗室間及各分析方法間的差異，根據各單位測定結果與靶值的離散程度，計算出該實驗室所的分數，及時反饋給參加者，便於改進工作。這就是室間質量評價的基本形式。室間質量評價主要是控制實驗室工作的不準確度，是對室內質量控制的補充。我國於2000年，由衛生部臨床檢驗中心開始組織開展臨床流式細胞術室間質評。現已開展了T細胞亞群檢測和CD34絕對計數的室間質評。

❽ Protein A與Protein G有何不同如何選擇一抗和二抗

一抗是能和非抗體性抗原（特異性抗原）特異性結合的蛋白。種類包括單克隆抗體和多克隆抗體。一抗可以特異性地結合底物，識別出我們想要檢測的東西。檢測任何靶蛋白都有多種抗體可供選擇，那如何進行一抗的選擇呢？
1）確定實驗樣本的種屬

確定自己實驗所用樣本的種屬，如human、rat、mouse、pig、goat等。應選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同源性較高。如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中，並不意味著該抗體不適用於檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過。可以通過序列比對的方法來預測交叉反應，可應用Expasy和NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。如果比對結果，證明同源性比較高的，也可以選擇。

（2）確定實驗類型

確定自己的實驗類型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗體說明書會列出該抗體經試驗驗證過適用於何種分析類型，如未提及並不意味著該抗體不適用於此種分析應用類型，而僅是說明尚未經過此種分析試驗驗證。如果抗體不適用某些分析試驗，則會在抗體說明書上標注出來不適於某分析試驗。

（3）分析 樣本蛋白的結構性質

分析了解樣本蛋白的結構性質有助於選擇合適的抗體，抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FCM流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。

（4）抗體宿主物種的選擇

一般說來，在使用偶聯二抗結合無偶聯物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對於免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，而是選兔源的一抗，二抗則可選擇偶聯了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大。

二抗是在其它宿主體內制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標簽。由於二抗所具備的優點使得其在免疫學實驗中得以應用廣泛，如ELISA（以偶聯有酶的抗體或抗原為標記來檢測特異性的蛋白質，尤其是相應的抗原或抗體），免疫組織化學（檢測組織中的特異性抗原），western blot（通過與特異性抗體結合來鑒定蛋白質），免疫沉澱（通過抗原與抗體的特異性結合作用來分離相應抗原）,免疫細胞化學（通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成），流式細胞術（通過檢測激光所激發熒光來鑒定分離不同類型的細胞）等。

二抗針對某一特定物種（如小鼠）的抗體均具有特異性，因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記，節省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子，從而使信號增強，提高了實驗靈敏度。二抗可以偶聯有幾種不同的標記，可以是酶，熒光素，或生物素。如何選擇二抗？通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進行考慮：

（1）一抗的種屬來源

根據一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。如果一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。

（2）一抗是屬於哪個類或亞類    

除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復雜些，由於單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應的二抗也需要根據這些亞型進行選擇。

（3）二抗的種屬來源

一般來說，不同的種屬來源與二抗的質量沒有必然的聯系，來源於山羊的二抗與來源於驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，此時二抗就不能選山羊或者小鼠來源的。選擇相應的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標的免疫實驗。雙標得2個都抗才行，故選擇第3個種源的抗體。

（4）選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，Fab片段，還是F(ab')2片段？

整個IgG分子 ：此種抗體適用於多數情況。

Fab 片段 ：它們只有一個結合位點，一般用來封閉內源性免疫球蛋白。

F(ab')2 片段 ：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用於結合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。

（5）二抗的偶聯標記

一般來講，偶聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和鹼性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC,  RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決於具體的實驗。對於western blot和ELISA，常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（組織免疫化學，細胞免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶標記的二抗。

（6）抗體的純度

親和層析純化的抗體一般更受歡迎，因為這些產品的純度更高，產生的非特異性背景也少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因為其中含有親和力高的抗體，尤其是當目的抗原存在的量較小的時候。

目前，絕大多數的IgG純化使用Protein A、Protein G親和層析，它們是來自於不同微生物的蛋白質，對於IgG具有特異性的親和作用，而對於其他雜蛋白沒有或者只有很弱的結合，因此具有極高的選擇性。通常，僅憑Protein A、Protein G一步親和層析就可達到90%的純度。但是Protein A、Protein G又有什麼不同呢？該如何選擇呢？

1.Protein A

Protein A是金黃色葡萄球菌表面的蛋白，分子量42kDa，有5個不同的結構域可以結合IgG的Fc片段，具有很強的特異性親和力，每個Protein A分子至少可以結合兩個IgG分子。同時，IgA、IgM或者IgE也有可能和Protein A結合。

nProtein A：天然Protein A，無動物來源組分，載量約30mg人IgG/ml。

rProtein A：重組Protein A ，C-端新增一個Cysteine，可以單一位點定向偶聯於瓊脂糖基架上，降低與抗體接觸的空間位阻，提高了載量，約50mg人IgG/ml。雅心重組蛋白A為本公司自主研發產品，非抗體柱純化，產品中無任何其它抗體如IgG等的污染；pH耐受范圍廣，可耐受0.5 M NaOH和0.5M HCl 處理，不降解，抗體結合能力不變。

2. Protein G

Protein G並不是我們熟知的G Protein（細胞表面G蛋白）， 而是G族鏈球菌的細胞表面蛋白，分子量25kDa，和IgG的Fc區域特異性結合，還能以低親力與Fab區域特異性的結合，但不與IgA和IgM結合。相比於Protein A，Protein G可以更廣泛、更強地、與更多類型的IgG結合，但是載量卻較低，約20mg人IgG/ml。

Protein A和Protein G的多個結構域可與IgG結合

Protein A 和 Protein G對於不同物種和亞型的IgG的親和力如下表；

Protein A與Protein G有何不同？如何選擇？ - 知乎 (hu.com)

：超級無敵大蝸牛：https://www.jianshu.com/p/7968913a8432

如何選擇一抗和二抗？ - 安必奇生物 (abace-biology.com)

❾ 流式細胞儀分析技術及應用

在2019年的三月份我正式開始做單細胞相關研究工作，有趣的同時也是朋友我們經常誤會的是：你是不是用流式細胞術？而我在得知自己要做這單細胞（single cell ）的研究時，在Google搜關鍵詞（single cell ），居然有不少是介紹流式細胞術的。流式細胞術應用到高通量測序領域就變成了微流控技術。可見，把生命科學的視界拉倒單細胞水平的比高通量測序更早的是流式細胞術。

那麼在單細胞測序技術出現之前，人們在研究單細胞的時候都是怎麼做的呢，都有哪些分析點呢？單細胞測序技術給單細胞研究帶來了哪些新的視角？這一切的答案都要求我們對流式細胞術有一個基本的了解。

流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量並可分類收集的高技術。

採用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。

（1） 液流系統
（2） 光學系統
（3） 數據處理系統

激光光源：氣冷式氬離子激光器
分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長
光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡
透鏡組：形成平行光，除去室內光
濾片：長通、短通、帶通
光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。

熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發後產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。
每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。
選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特徵。
線性放大器和對數放大器

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特徵的細胞需進一步培養和研究時進行的。

FS：反映顆粒的大小
SS：反映顆粒的內部結構復雜程度
FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少

單參數直方圖
雙參數直方圖:點圖
二維等高圖
假三維等高圖
三參數直方圖
多參數分析

雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。

雙參數信號通常採用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。

由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。
等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即「等高」。
曲線層次越高(越裡面的線) 所代表的細胞數愈多。
等高線越密集則表示細胞數變化率越大。

流式細胞儀(FCM)是集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，已廣泛應用於免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。

①細胞生物學 ：細胞凋亡研究；定量分析細胞周期並分選不同細胞周期時相的細胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達產物等物質與細胞增殖周期的關系，進行染色體核型分析，並可純化X或Y染色體。 [詳細]

②腫瘤學 ：DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標。近年來已應用DNA倍體測定技術，對白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。用單克降抗體技術清除血液中的腫瘤細胞。 [詳細]

③免疫學 ：研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關系；進行免疫活性細胞的分型與純化；分析淋巴細胞亞群與疾病的關系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植後的免疫學監測等。 [詳細]
④血液學 ：血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等；用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關系，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發生嚴重溶血；檢測血液中循環免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。 [詳細]

⑤葯物學 ：檢測葯物在細胞中的分布，研究葯的作用機制，亦可用於篩選新葯，如化療葯物對腫瘤的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調節蛋白等。 [詳細]

細胞凋亡研究 ：細胞凋亡是細胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發生、發展中有重要作用，因而研究細胞凋亡有重要意義。細胞凋亡檢測方法很多，應用流式細胞儀技術可根據細胞在凋亡過程中發生一系列形態、生化變化從多個角度對細胞凋亡進行定性和定量的測定。 [詳細]

** 細胞分選**：流式細胞儀能夠分選某一亞群細胞,分選純度＞95%。目前細胞分選主要用於研究，臨床應用較少。利用流式細胞儀分選免疫擔當細胞進行細胞免疫學研究也是目前的熱門課題。流式細胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細胞，只要你想得到的某一亞群細胞有合適的單克隆抗體標記。 [詳細]

** 細胞因子的檢測**：隨著多標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。本文主要對胞內細胞因子流式細胞技術作介紹。 [詳細]

** 血液學應用**：本文向您介紹流式細胞儀在血液研究領域的應用，包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等。 [詳細]

❿ 第一次做轉染試驗，請問怎樣計算轉染率，載體是帶GFP的，就是弄不明白是用熒光的個數比上接種細胞總數嗎

轉染率是大概估計一下，有熒光的占總細胞的比率，如果要精確值可以去做流式。